基因工程-5章文庫目的基因克隆

第五章

基因文庫的構(gòu)建與目的基因的克隆第一節(jié)基因文庫的構(gòu)建GeneticEngineering一、什么是基因文庫基因文庫（genelibrary）：從特定生物個體中分離的全部基因，這些基因可以存在于長期保存的穩(wěn)定的重組體中,需要時能夠隨時應(yīng)用它分離目的基因.這種保存基因組遺傳信息的材料稱為基因文庫（人工構(gòu)建）。建立基因文庫的目的:

便于目的基因的保存、擴(kuò)增和純化；是分離克隆目的基因的主要途徑；是復(fù)雜基因組作圖的重要依據(jù)。根據(jù)基因類型，基因文庫分為：基因組文庫(含有全部基因)cDNA文庫(含有全部蛋白質(zhì)編碼的結(jié)構(gòu)基因)基因組文庫：將某種生物細(xì)胞的整個基因組DNA切割成大小合適的片斷，并將所有這些片斷都與適當(dāng)?shù)妮d體連接，引入相應(yīng)的宿主細(xì)胞中，所有的抗性克隆組成了DNA片段的集合體，稱為基因組文庫。cDNA文庫：某生物某一發(fā)育時期所轉(zhuǎn)錄的mRNA全部經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。GeneticEngineering二、基因文庫構(gòu)建的基本戰(zhàn)略:用鳥槍法構(gòu)建基因組文庫,材料來自染色體DNA用cDNA法構(gòu)建cDNA文庫,材料來自mRNA在高度分化的生物體中，不同組織和細(xì)胞在不同時段的mRNA種類不同（即基因的表達(dá)譜不同），因此同種生物體的cDNA文庫一般還有組織細(xì)胞的界定，如肝組織cDNA文庫或胚胎組織cDNA文庫等.顯然，cDNA文庫的信息量遠(yuǎn)小于基因組文庫GeneticEngineering①重組克隆的總數(shù)不宜過大，以減輕篩選工作的壓力②載體的裝載量最好大于基因的長度，避免基因被分隔克?、劭寺∨c克隆之間必須存在足夠長度的重疊區(qū)域，以利克隆排序④克隆片段易于從載體分子上完整卸下⑤重組克隆能穩(wěn)定保存、擴(kuò)增、篩選理想的基因文庫應(yīng)具備下列條件：GeneticEngineering三、

基因組文庫構(gòu)建將某種生物細(xì)胞的整個基因組DNA切割成大小合適的片斷，并將所有這些片斷都與適當(dāng)?shù)妮d體連接，引入相應(yīng)的宿主細(xì)胞中，所有的抗性克隆組成了DNA片段的集合體，稱為基因組文庫。1.構(gòu)建基因組文庫的載體②目前常用的載體載體容量越大，所要求的DNA片斷數(shù)目越少。①對載體的要求

載體系列：容量為24kpcosmid載體：容量為50kbYAC：容量為1MbBAC:容量為300kbGeneticEngineering斷點(diǎn)完全隨機(jī)，片斷長度合適于載體連接。不能用一般的限制性內(nèi)切酶消化法。（1）染色體DNA大片段的制備2.基因組文庫構(gòu)建的一般步驟超聲波（300bp）或機(jī)械攪拌（8kb）。①物理切割法：內(nèi)切酶Sau3A進(jìn)行局部消化?？傻玫?0-30kb的隨機(jī)片斷。②酶切法：GeneticEngineering（2）載體與基因組DNA大片段的連接①粘性末端直接連接載體與外源DNA大片段的兩個末端都有相同的粘性末端。如：Sau3A與BamHI的酶切末端。直接連接、人工接頭或同聚物加尾②人工接頭法（adapter）人工合成的限制性內(nèi)切酶粘性末端片斷。GeneticEngineering各種酶的接頭可以向公司定做或購買。接上人工接頭粘性末端CCCCCC末端轉(zhuǎn)移酶粘性末端③同聚物加尾GeneticEngineeringGeneticEngineering3.基因組文庫的大小一個文庫要包含99%的基因組DNA時所需要的克隆數(shù)目。N=ln(1-p)ln(1-f)p:文庫包含整個基因組DNA的概率（99%）f:克隆片段的平均大小/生物基因組的大小N：基因組文庫最低所含克隆數(shù)GeneticEngineering例如：人的基因組是3×109bp，插入DNA片斷的平均長度如果是1.7×104bpN=ln(1-p)ln(1-f)=ln(1-99%)ln(1-f)=GfN=4.61×GfG：Genome大??；f：fragment大小N=4.61×Gf=4.61×3×1091.7×104=8.1×1054.61×GeneticEngineering二、cDNA文庫的構(gòu)建1.cDNA以mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄出的DNA稱cDNA2.cDNAlibrarymRNAcDNA3’3’5’5’反轉(zhuǎn)錄酶引物將某種生物的總mRNA合成cDNA，再將這些cDNA與載體連接，克隆到細(xì)菌細(xì)胞中，稱cDNA文庫。GeneticEngineering（1）不含內(nèi)含子序列（2）可以在細(xì)菌中直接表達(dá)（3）包含了所有編碼蛋白質(zhì)的基因（4）比DNA文庫小的多，容易構(gòu)建3.cDNA文庫的特點(diǎn)4.構(gòu)建cDNA文庫的載體絕大多數(shù)真核生物的mRNA小于10kb，因此用于cDNA文庫構(gòu)建的載體通常選質(zhì)粒.GeneticEngineering5.構(gòu)建cDNA文庫的一般步驟（1）總RNA（totalRNA）提取提取總RNA有商業(yè)化的試劑盒（kit）或者自己配制相關(guān)的試劑。利用mRNA含有的一段polyA尾巴，將mRNA從總RNA中分離純化。mRNA只占總RNA的1%-2%（2）mRNA的分離純化①原理GeneticEngineering采用用商業(yè)化的OligodT纖維柱②mRNA的分離純化Column（柱）當(dāng)總RNA通過已用oligo(dT)處理過的纖維素柱時，mRNA分子的poly(A)尾巴便會同oligo(dT)序列雜交而黏附到柱子的填充物纖維素上，而其余的rRNA及tRNA分子則流出柱子。GeneticEngineeringGeneticEngineering反轉(zhuǎn)錄酶（3）cDNA的合成①cDNA第一鏈合成逆轉(zhuǎn)錄酶能以mRNA為模板合成cDNA。用OligodT（或隨機(jī)引物）作引物，合成cDNA的第一鏈。mRNAcDNA3’5’5’AAAAAAATTTTTTTOligodT引物GeneticEngineering用堿處理或用RNaseH降解mRNA-DNA雜交分子中的mRNA。mRNAcDNA3’3’5’5’反轉(zhuǎn)錄酶引物mRNAcDNA第一鏈3’3’5’5’引物cDNA第一鏈3’5’引物②降解mRNA模板或RNaseH堿GeneticEngineering剩下的cDNA單鏈的3’末端一般形成一個彎回來的雙鏈發(fā)卡結(jié)構(gòu)（機(jī)理不明），可成為合成第二條cDNA鏈的引物。用DNA聚合酶合成第二鏈cDNA.。cDNA第一鏈5’cDNA第二鏈合成DNA聚合酶cDNA第一鏈cDNA第二鏈5’3’③cDNA第二鏈合成GeneticEngineering④去掉發(fā)卡結(jié)構(gòu)核酸酶S1用核酸酶S1可以切掉發(fā)卡結(jié)構(gòu)（但這會導(dǎo)致cDNA中有用的序列被切掉！）cDNA第一鏈cDNA第二鏈5’3’cDNA第一鏈cDNA第二鏈5’3’5’3’GeneticEngineeringGeneticEngineering這種酶能識別mRNA-cDNA雜交分子中的mRNA，并將其降解成許多小片斷。妙用RNaseH小片斷正好成為DNA聚合酶的引物，用來合成岡崎片斷。DNA連接酶將岡崎片斷連成一整條DNA鏈mRNAcDNA3’5’反轉(zhuǎn)錄酶引物mRNAcDNA第一鏈3’5’引物mRNAcDNA第一鏈3’5’mRNAmRNADNA聚合酶DNA聚合酶cDNA第二鏈cDNA第一鏈3’5’RNaseHDNAligaseGeneticEngineering在雙鏈cDNA末端接上人工接頭，即可與載體連接，轉(zhuǎn)入受體菌?；蚪柚┒宿D(zhuǎn)移酶給載體和雙鏈cDNA的3’端分別加上幾個C或G，成為粘性末端。（4）cDNA與載體連接接上人工接頭粘性末端CCCCCC末端轉(zhuǎn)移酶GeneticEngineering（5）導(dǎo)入受體細(xì)胞GeneticEngineering6.cDNA文庫的大小一個cDNA文庫要包含99%的mRNA時所需要的克隆數(shù)目。N=ln(1-p)ln(1-)p:文庫包含了完整mRNA的概率（99%）:某一種低豐度（不足14份拷貝）mRNA占細(xì)胞整個mRNA的比例N：文庫最低所含克隆數(shù)1n1n第二節(jié)目的基因的克隆GeneticEngineering“克隆”（clone）

個體水平上，表示由具有相同基因型的同一物種的兩個個體或數(shù)個個體組成的群體；細(xì)胞水平上，克隆一詞是指由同一個祖細(xì)胞（progenitorcell）分裂而來的一群遺傳上同一的子細(xì)胞群體；分子水平上，凡帶有一段DNA插入序列的、獨(dú)特的寄主/載體單元亦叫做克隆。外源基因與目的基因：把插入到載體內(nèi)的哪個特定的片段基因稱為“外源基因”。將那些已被分離或者準(zhǔn)備要被分離、改造擴(kuò)增或表達(dá)的特定基因DNA片段稱為“目的基因”?！傍B槍法”的概念直接從生物細(xì)胞基因組中獲取目的基因最常用的方法是“鳥槍法”，又稱為“散彈槍法”。是將基因組按染色體分開后，將其全部打亂，切成碎片，進(jìn)行隨機(jī)測定每個小片段序列，測序后利用計算機(jī)對這些切片進(jìn)行排序和組裝，并確定它們在基因組中的正確位置。一、鳥槍法克隆目的基因GeneticEngineering一、鳥槍法克隆目的基因基本戰(zhàn)略：將某種生物體的全基因組或單一染色體切成大小適宜的DNA片段，分別連接到載體DNA上，轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞，形成一套重組克隆，從中篩選出含有目的基因的期望重組子。GeneticEngineering操作程序（1）目的基因組DNA片段的制備超聲波處理：片段長度均一，大小可控，平頭末端全酶切：片段長度不均一，粘性末端便于連接，但有可能使目的基因斷開，大小不可控。部分酶切：片段長度可控，含有粘性末端，目的基因完整。GeneticEngineering（2）與載體連接一般選擇質(zhì)?；颚?DNA作為克隆載體（3）轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞多采用大