植物病毒病的診斷與鑒定課件

植物病毒病的診斷與鑒定

植物病毒病的診斷與鑒定

1植物病毒病的概況

2植物病毒的形態(tài)、結(jié)構(gòu)與組分

3植物病毒病的癥狀特點

4植物病毒的鑒定

5植物病毒病的綜合防治

1.植物病毒病的概況

病毒（Virus）是包被在蛋白或脂蛋白保護性衣殼中，只能在適合的寄主細胞內(nèi)完成自身復制的一個或多個基因組的核酸分子，又稱分子寄生物。

病毒區(qū)別于其他生物的主要特征是：

1.病毒是個體微小的分子寄生物，其結(jié)構(gòu)簡單；

2.專性寄生物，其繁殖需要寄主提供原料和場所。

按寄主性的不同，病毒分為寄生植物的植物病毒(PlantVirus)、寄生動物的動物病毒以及寄生細菌的噬菌體等。

1.植物病毒病的概述

植物病毒的危害及作用

???病毒引起的病害在數(shù)量上占植物病害的第二位。由植物病毒引起的植物病害的植物有：禾本科、茄科、豆科、十字花科和葫蘆科等。在遼寧省引起毀滅性的植物病毒病有番茄蕨葉病毒病，辣椒花葉病毒病和煙草脈壞死病毒病等。

生產(chǎn)上危害較大的植物病毒病害有：煙草花葉病、黃瓜花葉病、馬鈴薯病毒病、玉米矮花葉病等。

植物病毒也有可利用的價值，特別在開發(fā)基因工程的載體、轉(zhuǎn)基因植物研究等方面，發(fā)揮了很大的作用。

1.植物病毒病的概述

植物病毒學研究歷史：

1886年梅耶爾(Mayer)證明了煙草花葉病害的摩擦傳染性;1892年伊凡諾夫斯基(Ivanowski)發(fā)現(xiàn)了煙草花葉病的病原可以通過細菌過濾器；

1898年伯吉林克(Beijeincku)又發(fā)現(xiàn)該病原不是微生物，而是一種傳染性活液(contagiumvivumfluidum)，這就是Virus一詞的來源；

1935年，美國科學家斯坦利（Stanley）獲得了煙草花葉病毒的蛋白結(jié)晶,認為病毒是可在活細胞內(nèi)增殖的蛋白（1946年獲NobelPrizeinChemistry)。

1.植物病毒病的概述

植物病毒學研究歷史：

1936年英國科學家鮑登(Bawden)證明提純的TMV中含有核酸；

l939年Kausch通過電子顯微鏡觀察到植物病毒的形態(tài)；

1956年Gierrer證明去掉蛋白質(zhì)的RNA起重要侵染和繁殖作用；

1971年Diener發(fā)現(xiàn)了很小的RNA（250-400bps)稱為類病毒（viroid);1982年發(fā)現(xiàn)僅有蛋白質(zhì)的月元病毒

1/16/20201.植物病毒病的概述

植物病毒學研究歷史：

1981年，A.Lwoff在巴黎舉行的第五屆病毒學大會上，?這一法國病毒研究所

所長阿爾．沃夫，認為病毒不是生物，他的觀點如下：

?????????

生長和分裂

獨立進化

獨立的生命體

活的

原

生

生

物

＋

＋

＋

＋

細

胞

＋

－

－

＋

線粒體和葉綠體

＋

－

－

－

膜

＋

－

－

－

染色體、質(zhì)體含核酸

－

－

－

－

病

毒

－

－

－

－

綜上所述，認為病毒是有機物，而不是生物。

1/16/20201.植物病毒的概述

植物病毒的命名

???植物病毒的名稱目前不采用拉丁文雙名法，仍以寄主英文俗名加上癥狀來命名，如煙草花葉病毒為Tobaccomosaicvirus，縮寫為TMV；黃瓜花葉病毒為Cucumbermosaicvirus，縮寫為CMV。

屬名為專用國際名稱，常由典型成員寄主名稱(英文或拉丁文)縮寫十主要特點描述(英文或拉丁文)縮寫十virus拼組而成。如：黃瓜花葉病毒屬的學名為Cucu—mo—virus；煙草花葉病毒屬為Toba—mo—virus。即植物病毒屬的結(jié)尾是一virus，科、屬名書寫時應用斜體，而種和株系的書寫不采用斜體。

類病毒(viroid)在命名時遵循相似于病毒的規(guī)則，因縮寫名易與病毒混淆，新命名規(guī)則規(guī)定類病毒的縮寫為Vd，如馬鈴薯紡錘塊莖類病毒(Potatospindletuberviroid)縮寫為PSTVd。1/16/20202.植物病毒的形態(tài)、結(jié)構(gòu)與組成

2.1植物病毒的形態(tài)

?????觀察需要電子顯微鏡，度量尺度為納米(nm)。

植物病毒的基本形態(tài)為球狀、桿狀和線條狀。

球狀病毒的直徑大多在20一35nm，少數(shù)可以達到70-80nm，球狀病毒也稱為多面體病毒或二十面體(icosahedralparticle)病毒。

桿狀病毒多為20-80nm×100-250nm，兩端平齊；少數(shù)兩端鈍圓，線狀病毒多為11—13nm×750nm，個別可以達到2000nm以上。還有少數(shù)病毒與以上形態(tài)不同，它們有的看上去是兩個球狀病毒聯(lián)合在一起，被稱為雙聯(lián)病毒(或雙生病毒)；有的像彈頭，被稱為彈狀病毒；還有的呈絲線狀，柔軟不定形。

1/16/20202.2植物病毒的結(jié)構(gòu)

???中間核酸，外為蛋白質(zhì)衣殼，由許多蛋白質(zhì)亞基組成，核酸和蛋白質(zhì)亞基均呈螺旋狀排列。桿狀或條狀病毒的粒體是空心的。

TMV為棒狀，CMV球狀的。

球狀病毒：20面體，蛋白質(zhì)亞基為60個或60的倍數(shù)，蛋白質(zhì)亞基在每個面上不呈螺旋狀排列，鑲嵌在表面，粒體中心也是空的。核酸鏈排列還不清楚。

1/16/20202.3植物病毒的組成

???植物病毒主要成分是核酸和蛋白質(zhì)，核酸在內(nèi)部，外部由蛋白質(zhì)包被，稱為外殼，有的病毒粒體中還含有少量的糖蛋白或脂類。

構(gòu)成病毒的成分：核酸5--40%，蛋白質(zhì)60-95%，還有水分和礦物質(zhì)等。

類病毒和擬病毒無蛋白衣殼，無?；匝鍖W反應，真病毒有專化性血清反應。

1/16/2020植物病毒主要類型

1.長而彎曲的線狀粒體2.僵直的桿狀粒體3.示桿狀或線狀病毒核酸與蛋白亞基的排列4.桿菌狀粒體5.桿菌狀粒體橫切面6.多角體病毒粒體

7.二十面體的核酸與蛋白亞基的排列

1/16/20203.植物病毒病的癥狀特征

一、外部癥狀(Symptom)：

病毒病害在癥狀表現(xiàn)上多為系統(tǒng)發(fā)病，表現(xiàn)為變色、畸形，少數(shù)引起壞死、腐爛，萎蔫極少發(fā)生。

變色：花葉(mosaic)，黃化(yellow)。

壞死(negrosis)：也稱作枯斑反應，如TMV侵染心葉煙表現(xiàn)為壞死枯斑，馬鈴薯Ｙ病毒的某些株系侵染煙草可產(chǎn)生脈壞死。

畸形：抑制型：矮化(dwarf)，卷葉(leafroll)，皺葉?(rugose)，蕨葉(fernleaf)。

刺激型：叢生(rosette)，腫瘤(tumor)。

1/16/20201/16/2020花葉（變色界限明顯）

1/16/2020葉片卷曲

1/16/20203.植物病毒病的癥狀特征

二、

病組織的內(nèi)部和細胞的變化：

1.組織變化：

組織壞死：如煙草花葉病毒TMV，它侵染心葉煙引起薄壁組織壞死，有些引起莖部維管束和葉部壞死，煙草花葉病毒侵染大豆引起頂芽和側(cè)枝壞死。一般引起黃化類型的病毒病多是因輸導組織、韌皮部壞死引起。

組織增生：病毒侵染后，寄主植物體內(nèi)代謝失調(diào)，產(chǎn)生激素，引起增生。

1/16/20201/16/20203.植物病毒病的癥狀特征

2.細胞的變化：

花葉和斑駁是由于細胞內(nèi)葉綠素遭到破壞所致。

內(nèi)含體(inclussion)：某些植物被病毒侵染后，在病組織中產(chǎn)生的一種特殊結(jié)構(gòu)，存在于細胞質(zhì)或細胞核中，在顯微鏡下可以觀察到。分為不定型內(nèi)含體Ｘ－體和結(jié)晶體。

結(jié)晶體：有六角型、長條型、正四面體型等，個別的還有皿狀，無色透明，主要是由病毒粒體和寄主的蛋白質(zhì)有規(guī)則地排列形成。Ｘ－體：無一定形狀，半透明，通常外有一層膜，也是由病毒粒體和寄主物質(zhì)構(gòu)成

內(nèi)含體的作用：①植物患病毒病后才有，因此，可作為一種診斷的指標。

②但并不是所有的病毒病都有內(nèi)含體，有些必須發(fā)育到一定階段才形成，同時一種病毒還可有多種形態(tài)的內(nèi)含體，因此，單靠內(nèi)含體診斷還有一定的局限性。

1/16/20201/16/20203.植物病毒病的癥狀特征

三、患病植物的生理變化：

表現(xiàn)為：

①病毒侵染后呼吸強度先上升，后下降。

②碳水化合物含量下降。

③淀粉在葉部積累引起黃化。

④多酚氧化酶和細胞色素氧化酶的活性增強，使細胞中毒壞死。

⑤光合作用下降，破壞了寄主的葉綠素。

⑥植物內(nèi)源激素水平失去平衡，造成畸形。

1/16/20203.植物病毒病的癥狀特征

四、癥狀變化：

一種病毒引起的癥狀可因病毒、寄主和環(huán)境三方面的因素而改變。

1.病毒本身：

①病毒的株系(Strain)：同一種病毒在致病性上也有差異，也稱為病毒的生理小種，為了便于與真菌生理小種的區(qū)別，稱為株系。有強株系(癥狀表現(xiàn)明顯，危害較大)和弱株系(癥狀不太明顯)。

如：TMV(弱株系)番茄

花葉或斑駁

TMV番茄條斑株系(強株系)壞死，條斑

TMV弱株系侵染煙草引起輕微斑駁，強株系則引起嚴重花葉。

TMV（煙草花葉病毒）

1/16/20203.植物病毒病的癥狀特征

???????②交互保護作用(crossprotection)：同一種病毒的弱株系先接種植物后，就可以保護寄主免受病毒強株系的嚴重傷害，即先侵染的病毒可以保護植物不再受親緣關系較近的另一種病毒的侵染。

如果兩種病毒無親緣關系則沒有這種保護作用。

③拮抗作用和協(xié)生作用：

拮抗作用：一種病毒侵染寄主植物后，可抑制另一種病毒再對植物的侵染。如煙草蝕紋病毒可抑制天仙子花葉病毒和馬鈴薯Ｙ病毒對煙草的侵染。

協(xié)生作用：兩種病毒侵染一種寄主植物后，可使癥狀比單獨侵染時更為嚴重，加劇為害。

如：番茄花葉病毒

輕微斑駁>番茄

壞死

馬鈴薯Ｘ病毒

輕微斑駁

1/16/20203.植物病毒病的癥狀特征

2.寄主因素：

①一種病毒在不同寄主上可表現(xiàn)不同癥狀。

如：TMV普通煙──全株型花葉癥狀

心葉煙──局部性壞死枯斑

②潛伏侵染：一種病毒感染某些植物后，可以侵染但不表現(xiàn)癥狀的現(xiàn)象。

如：小麥黃矮病毒在除小麥之外的禾本科作物上不表現(xiàn)癥狀。

③同一種病毒侵染同種寄主的不同品種上表現(xiàn)不同：

a.抗病品種：產(chǎn)生局部枯斑反應。TMV──心葉煙。

b.高抗或免疫品種品種：病毒侵入后增殖量很少或不能增殖。

c.耐病品種：侵染寄主后可大量繁殖，但表現(xiàn)癥狀很輕微，這與真菌耐病性不同。

1/16/20203.植物病毒病的癥狀特征

3.環(huán)境因素：環(huán)境因素可抑制或改變癥狀的表現(xiàn)。

（1）溫度：〉35℃或〈10℃病害癥狀輕微，特別是對于花

葉病，如油菜花葉病和TMV。

隱癥：已經(jīng)表現(xiàn)病毒病癥狀的植株，由于環(huán)境條件改變，癥狀消失的現(xiàn)象。這種隱癥在條件合適時又可重新表現(xiàn)癥狀。

隱癥：條件不同。

潛伏侵染：寄主不同。

（2）光照：過強、過弱都會影響癥狀的表現(xiàn)。多數(shù)在光弱時花葉病癥狀容易表現(xiàn)，接種易成功

1/16/20204.植物病毒的鑒定

????植物病毒的分類是將已知病毒按一定標準、相似程度或相關性的順序排列，拼成一個系統(tǒng)，即分類系統(tǒng)。

植物病毒鑒定的主要目的是確定一種病毒在分類系統(tǒng)中的地位，由于植物病毒個體微小，結(jié)構(gòu)簡單，對寄主的依賴性強，鑒定工作難度大，技術性強，對工作條件的要求高。

鑒定植物病毒過去大多采用病毒間生物學特性的差異，如所致癥狀類型、傳播方式、寄主范圍等；現(xiàn)在則增加了病毒核酸、蛋白分子生物學、生物化學等方面的方法。

常用的方法有生物學實驗、血清學檢測和電子顯微鏡觀察等。

1/16/2020一、生物學實驗

??????生物學實驗的目的是確定病原的侵染性，用實驗方法證明病毒與病害的直接相關性。

生物學實驗還可以確定病毒的傳播方式，明確病毒所致病害的癥狀類型和寄主范圍。在分子生物學技術尚欠發(fā)展的過去，只有生物學方法可以區(qū)分在遺傳信息上一個核苷酸或者蛋白質(zhì)中一個氨基酸的變異，因此生物學實驗是其它實驗方法所不可取代的。

生物學實驗中應用最多的是鑒別寄主，即用來鑒別病毒或其株系的具有待定反應的植物。

凡是病毒侵染后能產(chǎn)生快而穩(wěn)定、并具有特征性癥狀的植物都可作為鑒別寄主。

組合使用的幾種或一套鑒別寄主稱為鑒別寄主譜。鑒別寄主譜中一般包括可系統(tǒng)侵柒的寄主、局部侵染的寄主和不受侵染的寄主。如若區(qū)分經(jīng)常出現(xiàn)的黃瓜花葉病毒屬的三個成員，采用表4—1的鑒別寄主。

。

1/16/2020表4-1黃瓜花葉病毒屬三種病毒

在鑒別寄主植物上的癥狀反應

鑒別寄主

黃瓜花葉病毒

花生矮化病毒

番茄不孕病毒

花生

無病癥

褪綠，矮花葉

無癥狀

菊花

不侵染

？

侵染

黃瓜

花葉

花葉

無花葉

1/16/2020二、電子顯微鏡技術

??與光學顯微鏡相比，電子顯微鏡使用光源的波長更短(屬于短波電子流)，因此分辨率也大大提高(9.9×l0-11m，比光學顯微鏡高千倍以上)。但是電子束的穿透力低，樣品厚度必須在10~100nm之間。所以電鏡觀察需要特殊的載網(wǎng)和支持膜，需要復雜的制樣和切片過程。

病毒觀察最常用的是負染技術和免疫電鏡技術。所謂負染，是指通過重金屬鹽在樣品四周的堆積而加強樣品外圍的電子密度，使樣品顯示負的反差，襯托出樣品的形態(tài)和大小。與超薄切片(正染色)技術相比，負染不僅快速簡易，而且分辨率高，目前廣泛用于生物大分子、細菌、原生動物、亞細胞碎片、分離的細胞器、蛋白晶體的觀察及免疫學和細胞化學的研究工作中，尤其是病毒的快速鑒定及其結(jié)構(gòu)研究所必不可少的一

項技術。

1/16/2020三、血清學技術

?

抗血清制備：利用植物病毒衣殼蛋白的抗原(antigen)特性，可以制備病毒特異性的抗血清(antiserum)。先將純化的植物病毒注射小動物(兔子、小白鼠、雞等)，一定時間后取血，獲得抗血清。血清制備的關鍵是病毒的純化，純度高的病毒才能獲得特異性強的抗血清。血清反應植物病毒與其血清的反應有好多種，但依據(jù)的原理都是抗原與抗體的特異性結(jié)合。最常用的兩種方法是瓊脂雙擴散和酶聯(lián)免疫吸附測定法。

1/16/2020??瓊脂雙擴散法：在一定濃度的瓊脂凝膠中，抗體和抗原互相擴散，在適當?shù)奈恢眯纬沙恋恚怀恋砭€的形狀說明抗原和抗體的相互關系。

酶聯(lián)免疫吸附(EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay，ELISA)法：該方法利用了酶的放大作用，使免疫檢測的靈敏度大大提高。與其它檢測方法相比較，ELISA有突出的優(yōu)點：一是靈敏度高，檢測濃度可達1-10ng／m1;二是快速，結(jié)果可在幾個小時內(nèi)得到；三?；詮?，重復性好；四是檢測對象廣，可用于粗汁液或提純液，對完整的和降解的病毒粒體都可檢測，一般不受抗原形態(tài)的影響；五是適用于處理大批樣品，所用基本儀器簡單，試劑價格較低,且可較長期保存。具有自動化及試劑盒的發(fā)展?jié)摿ΑLISA是實現(xiàn)“快速、準確、經(jīng)濟”檢測的最好手段之一

1/16/2020四、核酸雜交及PCR技術

???血清學技術利用的是病毒衣殼蛋白的抗原性，檢測的目標是蛋白。由于核酸才是有侵染性的，僅僅檢測到蛋白并不能肯定病毒有無生物活性。因此，核酸檢測技術也是鑒定植物病毒的更可靠方法，主要有核酸雜交和聚合酶鏈式反應(PCR)方法比較常用。

核酸雜交主要在DNA和RNA之間進行，依據(jù)是RNA與互補的DNA之間存在著堿基的互補關系。在一定的條件下，RNA--DNA形成異質(zhì)雙鏈的過程稱為雜交。其中預先分離純化或合成的已知核酸序列片段叫做雜交探針(Probe)，由于大多數(shù)植物病毒的核酸是RNA，其探針為互補DNA(complementaryDNA，cDNA)，也稱為cDNA探針。

核酸檢測不僅可以檢測到目標病毒的核酸，而且還可以檢測出相

近病毒(或核酸)間的同源程度。

1/16/2020??聚合酶鏈式反應(PCR)是在短時間內(nèi)大量擴增核酸的有效方法，用于擴增位于兩段已知序列之間的DNA區(qū)段。從已知序列合成兩段寡聚核苷酸作為反應的引物，它們分別與模板DNA兩條鏈上的各一段序列互補且位于待擴增DNA區(qū)段的兩側(cè)。反應時，首先在過量的兩種引物及4種dNTP參與下對模板DNA進行加熱變性。隨之將反應混合液冷卻至某一溫度使引物與其靶序列發(fā)生退火。此后退火引物在耐熱的洲A聚合酶作用下得以延伸。如此反復進行變性、退火和DNA合成這一循環(huán)。每完成一個循環(huán)，理論上就使目的DNA產(chǎn)物增加1倍，在正常反應條件下，經(jīng)25—30個循環(huán)擴增倍數(shù)可達百萬。

PCR擴增在檢測標本中病原的核酸序列、由少量RNA生成cDNA文庫、生成大量DNA以進行序列測定、突變的分析等方向已經(jīng)得到廣泛的應用。

1/16/2020五、物理化學等特征

????

在植物病毒研究的過程中，人們發(fā)現(xiàn)不同的病毒對外界條件的穩(wěn)定性不同，這便成為區(qū)別不同病毒的依據(jù)之一。隨著新病毒種類的發(fā)現(xiàn)和分子生物學研究的深入，人們也逐漸認識到這些物理特性在區(qū)分不同病毒中的局限性。

1.稀釋限點(DilutionEndPoint，DEP)保持病毒侵染力的最高稀釋度，用10-1，10-2，10-3……表示，它反映了病毒的體外穩(wěn)定性和侵染能力，也象征著病毒濃度的高低。

2.鈍化溫