分離分析新技術(shù)

分離分析新技術(shù)在天然藥物研究中的應(yīng)用

馬建蘋TelO)E-mail:majp326@

超臨界流體萃取技術(shù)一.基本原理1.超臨界流體的特性

相態(tài)性質(zhì)氣體超臨界流體液體密度(kg/m3)1.07.0102

1.0103黏度(Pa·s)10-6~10-510-510-4擴(kuò)散系數(shù)(m2/s)10-510-710-9(1)被提取物的性質(zhì)(2)壓力的影響(3)溫度的影響(4)夾帶劑的影響2.超臨界CO2流體的溶解性能3.超臨界CO2流體萃取的優(yōu)勢(1)防止熱敏性物質(zhì)可能產(chǎn)生的氧化和分解,保持各組分的原有特性。(2)無溶劑殘留問題。(3)實現(xiàn)選擇性提取。(4)提取較完全。(5)儀器聯(lián)用,實現(xiàn)高效、快速、準(zhǔn)確分析。(6)CO2超臨界流體適合于工業(yè)化生產(chǎn)。萃取釜減壓閥分離釜加壓泵4.超臨界CO2流體萃取設(shè)備簡介蜂膠的SFE純化流程(1)萃取壓力(2)萃取溫度(3)CO2流量(4)萃取時間(5)粒度(6)夾帶劑二.超臨界CO2流體萃取工藝的影響因素1.超臨界CO2流體萃取穿心蓮有效成分功效：清熱解毒、消腫止痛。有效成分：二萜內(nèi)酯類化合物(穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯、去氧穿心蓮內(nèi)酯)傳統(tǒng)方法：水提法：ChP1990淘汰醇提法：熱浸：得率較高、有效成分容易分解或聚合、雜質(zhì)較多冷浸：質(zhì)量較好、雜質(zhì)少、有效成分不分解、生產(chǎn)周期較長超臨界CO2流體萃取法：所得有效成分含量較高、具有該藥的天然香味三.超臨界流體萃取在天然藥物提取中的應(yīng)用穿心蓮不同提取方法所得浸膏的質(zhì)量比較質(zhì)量指標(biāo)超臨界CO2流體95%乙醇提取穿心蓮內(nèi)酯脫水穿心蓮內(nèi)酯總內(nèi)酯含量總內(nèi)酯提取率色澤氣味雜質(zhì)有效成分制藥干燥損失成藥中藥粉流動性藥粉外觀藥粉氣味藥效19%12%42%98%墨綠色(原藥色)原藥香味少1/10好墨綠色、干爽、油脂多含原料藥香氣好、穩(wěn)定10%4%24%60%深棕色焦味多1/3差棕色、結(jié)塊、油脂少無差、不穩(wěn)定2.揮發(fā)油的提取傳統(tǒng)提取方法的缺點：易造成揮發(fā)油的分解或氧化等；收率普遍較低實例：月見草油SFE提取,25MPa,50℃萃取率20%-亞麻酸10.6%

色澤與透明度

-亞麻酸杏仁油：SFE與石油醚提取工藝比較收油率是后者的2.5倍

薄荷揮發(fā)油：23MPa,55℃加7%乙醇夾帶劑薄荷醇收率0.16%

比水蒸汽蒸餾法高3倍比有機(jī)溶劑法高0.6倍

優(yōu)于溶劑法四.超臨界流體萃取技術(shù)展望(1)成本上難以與傳統(tǒng)提取工藝競爭(2)對許多強(qiáng)極性和分子量較大的成分很難進(jìn)行有效地提取(3)基礎(chǔ)研究比較薄弱(4)需要結(jié)合傳統(tǒng)中藥所要求的藥效來考察有效成分是否被萃取出及性能是否穩(wěn)定(5)考慮中藥成分的協(xié)同和互溶作用大孔樹脂吸附分離技術(shù)一.大孔吸附樹脂的結(jié)構(gòu)、原理和特點1.大孔吸附樹脂的結(jié)構(gòu)、原理及種類(1)結(jié)構(gòu)新型非離子型高分子聚合物吸附劑白色球形顆粒20-60目具多孔性聚合單體苯乙烯交聯(lián)劑二乙烯苯致孔劑甲苯、二甲苯(2)分離原理吸附性和篩選性相結(jié)合(3)大孔樹脂的種類按化學(xué)結(jié)構(gòu)分為以下四類：非極性如苯乙烯、二乙烯苯聚合物中極性存在極性基團(tuán)－COOR,具有一定的極性極性含硫氧、酰胺、腈等基團(tuán)如丙烯酰胺極性大于酯基強(qiáng)極性如吡啶基、氨基等

牌號生產(chǎn)廠結(jié)構(gòu)比表面積孔徑（nm）非極性AmberliteXAD-2羅姆－哈斯（美）PS3304.0AmberliteXAD-3羅姆－哈斯（美）PS5264.4AmberliteXAD-4羅姆－哈斯（美）PS7505.0ADS-5南開大學(xué)PS55020-25ADS-3南開大學(xué)PS10005-6AmberliteXAD-6羅姆－哈斯（美）-COOR4986.3AmberliteXAD-7羅姆－哈斯（美）-COOR4508.0ADS-8南開大學(xué)-COOR14025.0AmberliteXAD-9羅姆－哈斯（美）

AmberliteXAD-10羅姆－哈斯（美）2508.0ADS-16南開大學(xué)酰胺6935.2AmberliteXAD-11羅姆－哈斯（美）氧化氮類170AmberliteXAD-12羅姆－哈斯（美）氧化氮類2521.0ADS-7南開大學(xué)-NR200130一些代表性的大孔吸附樹脂2.大孔吸附樹脂的特點(1)分離性能優(yōu)良選擇性良好分離效能高脫色能力強(qiáng)(2)理化性質(zhì)穩(wěn)定穩(wěn)定性高機(jī)械強(qiáng)度好經(jīng)久耐用避免環(huán)境污染和對設(shè)備的腐蝕(3)應(yīng)用范圍廣與離子交換樹脂相比

pH不變發(fā)酵液分離抗生素(4)使用方便流體阻力小(5)溶劑用量少避免乳化現(xiàn)象提高提取效率(6)可重復(fù)使用再生容易(7)其他方面價格較貴吸附效率易受流速和溶質(zhì)濃度的影響品種有限操作較復(fù)雜對樹脂的技術(shù)要求較高二.大孔吸附樹脂吸附分離技術(shù)要求大致操作步驟：樹脂預(yù)處理－樹脂上柱－藥液上柱－樹脂的解吸－樹脂的清洗、再生樹脂預(yù)處理：加甲醇或丙酮浸泡24小時，加熱回流洗脫裝柱：蒸餾水濕法裝柱，乙醇流動清洗，大量蒸餾水清洗藥液的上柱吸附：（1）泄漏曲線與吸附容量的考察（2）藥液上柱前的預(yù)處理（3）上柱工藝條件的選擇樹脂自身特性、樣品濃度、pH值、吸附柱徑高比、上樣流速（4）樹脂的解吸樹脂的清洗、再生：無水乙醇或95％乙醇洗至無色，大量水洗去醇三.大孔吸附樹脂技術(shù)在天然藥物提取純化中的應(yīng)用在天然藥物有效成分的提取、純化領(lǐng)域大有用途：1.許多提取成功的單味中草藥，奠定良好的基礎(chǔ)2.不斷有新型的吸附樹脂問世到目前為止,已成功用于黃酮類、皂苷類、生物堿類、酯類、萜類等成分的分離1.黃酮類藥物的提取實例：銀杏葉提取物（GBE）

主要有效成分黃酮苷

萜內(nèi)酯

溶劑萃取法>24％>6％樹脂吸附法AmberliteXAD-7>30％未達(dá)標(biāo)

Duolite-761達(dá)標(biāo)達(dá)標(biāo)

ADS-F860~65％25~30％

其他中草藥：毛冬青根、山楂、葛根、黃芩根、苦蕎麥、沙棘等2.皂苷類藥物的提取實例：絞股藍(lán)皂苷

研制出強(qiáng)極性吸附樹脂ADS-7、S-038S-038，吸附量達(dá)65.5mg/ml，70％乙醇洗脫

人參皂苷吸附和脫色雙重作用

ADS-7，70％乙醇洗脫，粗品（棕色）白色或微黃色實例：絞股藍(lán)皂苷

絞股藍(lán)：葫蘆科植物絞股藍(lán)的根狀莖或全草，多年生草質(zhì)藤本植物功效：鎮(zhèn)咳、清熱解毒有效成分：皂苷、黃酮類、多糖類“綠色的金子”“第二人參”“人參寶草”提取工藝：絞股藍(lán)干莖葉熱水浸提浸提除雜樹脂吸附乙醇解吸脫色濃縮干燥粉碎絞股藍(lán)皂苷粉末7-8倍熱水浸提三次調(diào)節(jié)酸堿性靜置除雜DA大孔樹脂水洗除雜50%乙醇70%乙醇DB樹脂真空干燥80-100目3.生物堿的提取實例：喜樹堿

弱堿AB-8pH8，鹽濃度(1-2.5)mol/L,吸附量達(dá)160mg/g

小檗堿

堿性大水溶性大

10%H2SO4,10%NaOH,非極性吸附樹脂小檗堿含量為原生藥含量的97%4.影響大孔樹脂分離純化天然藥物效果的因素(1)樹脂性質(zhì)吸附容量大吸附速度快機(jī)械強(qiáng)度好(2)藥液pH

酸性物質(zhì)易在酸性溶液中被吸附

堿性物質(zhì)在堿性溶液中被吸附(3)藥液濃度

符合Frendich和Augmur經(jīng)典吸附式

(4)上柱液溫度室溫(5)鹽濃度無機(jī)鹽的加入降低了吸附質(zhì)在介質(zhì)內(nèi)的溶解度(6)樹脂柱徑高比合適的徑高比為分離提供較高的柱效(7)樹脂柱的清洗

非吸附性成分水吸附性雜質(zhì)一定濃度的酸或堿液(0.1-1.0MNaOH或HCl)(8)洗脫液的選擇及解吸制備色譜技術(shù)色譜技術(shù)：有效成分的定性與定量工作開發(fā)出療效好、質(zhì)量指標(biāo)明確的中藥新藥一.色譜技術(shù)的基本原理按照分離過程的原理不同分為：吸附色譜分配色譜離子交換色譜凝膠色譜親和色譜二.制備色譜工藝流程單色譜柱：最簡單、最為常用，能分離復(fù)雜組分的混合物溶劑消耗量大，回收溶劑的能耗高模擬移動床色譜：分離效率高、溶劑消耗低、便于連續(xù)操作設(shè)備復(fù)雜、工藝要求高柱切換、移動進(jìn)料和移動接口色譜等：實現(xiàn)復(fù)雜組分分離、大大提高吸附劑生產(chǎn)率、減少溶劑消耗、減少設(shè)備投資和操作費用三.常用的制備色譜工藝1.薄層色譜

操作簡單、費用低廉、應(yīng)用廣泛新型薄層色譜法離心制備薄層色譜（PCLC）旋轉(zhuǎn)離心、連續(xù)洗脫的圓形色譜技術(shù)，分離效果優(yōu)于常規(guī)的制備薄層色譜和柱色譜獨特的優(yōu)點：對固定相不會造成損壞裝填容量、分離速度和分離效能得到極大提高實例：龍膽屬植物Sstrictiffora

甲醇提取物

bellidifolin和desmethylbellidifolin

離心薄層色譜法聚酰胺開口柱色譜

30min.12hr.2.柱色譜特殊的柱色譜：（1）干柱色譜干法裝填－上樣－洗脫－推出、切割－譜帶溶劑萃取特點：溶劑消耗很少，操作迅速（15～30min）（2）真空液相色譜(VLC)抽真空裝柱－低極性溶劑沖柱－上樣－洗脫－收集餾分、抽干特點：操作簡便、處理量大（一次可達(dá)30g）3.壓力液相色譜(PLC)閃蒸色譜(約0.2MPa)

價格低廉、操作方便低壓液相色譜(<0.5MPa)

負(fù)荷量克級、分辨率有時與HPLC接近中壓液相色譜(0.5～2.0MPa)負(fù)荷量1～100g、分離時間短、適宜工業(yè)化高壓液相色譜(>2.0MPa)

分離效率高、應(yīng)用范圍廣實例：銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B、白果內(nèi)酯的分離純化硅膠H柱(10-40m)流動相：乙酸乙酯－石油醚（8：2）(5)超臨界流體色譜介于液相色譜和氣相色譜之間的色譜方法特點：分離速度快、產(chǎn)品易回收、應(yīng)用范圍廣、有可能替代正相HPLC4.離子交換色譜固定相：離子交換樹脂可再生性和重復(fù)使用性交換功能基團(tuán)：陽離子和陰離子形態(tài)：凝膠型（水溶脹）和大孔型（永久性微孔）特點：使用方便、成本低廉、重復(fù)使用性好、分離速度快應(yīng)用范圍：生物堿、糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)以及核酸實例：總生物堿制備生藥粗粉－0.1%HCl滲漉－強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂－蒸餾水洗樹脂倒出晾干－10%NaOH堿化樹脂－氯仿回流－干燥－重結(jié)晶

5.逆流色譜

(CCC)以液相物質(zhì)為固定相的液－液色譜離心逆流色譜(CCCC)：（1）分離物質(zhì)的極性范圍很寬（2）沒有拖尾現(xiàn)象（3）樣品定量回收實例：銀杏葉中的黃酮糖苷

固定相：水，流動相：乙酸乙酯－乙酸乙酯（異丁醇）－乙酸乙酯/異丁醇(6:4)高速逆流色譜(HSCCC)6.其他形式色譜體積排阻色譜分子篩機(jī)理凝膠過濾色譜凝膠滲透色譜優(yōu)點：操作簡單、快捷、流動相選擇寬泛(2)親和色譜大多被利用來分離純化生物大分子載體：瓊脂糖凝膠、交聯(lián)葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠(3)疏水作用色譜主要分離對象為蛋白質(zhì)特點：分離條件溫和，易于保持生物蛋白質(zhì)的活性7.多種色譜方法的聯(lián)用最初分離步驟：如閃蒸色譜、逆流色譜或凝膠過濾色譜等最后的純化過程：如HPLC實例：生物堿

液相色譜法－排阻色譜法實例：水飛薊黃酮的提取

水飛薊：也叫乳薊，菊科植物，一年或兩年生草本功效：抗肝臟中毒和保護(hù)肝細(xì)胞有效成分：水飛薊素提取工藝：水飛薊種子去油種子餅去油種子渣過濾提取液