青蒿素gai-合成生物學-青蒿素在合成生物學中的課件

青蒿素在合成生物學中的研究進展青蒿素在合成生物學中的研究進展1CONTENTS簡介:青蒿素與合成生物學青蒿素的生物合成主要包括四大步驟提高工程菌中目的產(chǎn)物產(chǎn)量的措施工業(yè)化研究進展研究展望參考文獻CONTENTS簡介:青蒿素與合成生物學青蒿素的生物合成主要2Part1：

簡介:青蒿素與合成生物學青蒿素(artemisinin)是中國科學家于20世紀70年代從傳統(tǒng)中草藥青蒿或稱黃花蒿中分離提純的抗瘧有效單體,其化學本質(zhì)是含“過氧橋”結(jié)構(gòu)(1,2,4-三噁烷環(huán))的倍半萜內(nèi)酯。合成生物學與傳統(tǒng)生物學通過解剖生命體以研究其內(nèi)在構(gòu)造的辦法不同，合成生物學的研究方向完全是相反的，它是從最基本的要素開始一步步建立零部件。與基因工程把一個物種的基因延續(xù)、改變并轉(zhuǎn)移至另一物種的作法不同，合成生物學的目的在于建立人工生物系統(tǒng)（artificialbiosystem），讓它們像電路一樣運行。通過合成生物學技術(shù)來制備青蒿素,利用細胞工廠將是未來青蒿素生產(chǎn)的主要方式。BouwmeesteraHJ,WallaartbTE,JanssenaMHA,etal.Amorpha-4,11-dienesynthasecatalysesthefirstprobablestepinartemisininbiosynthesis[J].Phytochemistry,1999,52:843?854.Part1：簡介:青蒿素與合成生物學青蒿素(a3Part2：青蒿素的生物合成主要包括四大步驟第一步是通過甲羥戊酸途徑和非甲羥戊酸兩條途徑形成法尼基焦磷酸（FPP)第二步是在紫穗槐-4,11-二烯合酶（ADS）的作用下將FPP環(huán)化形成青蒿素的中間體紫穗槐-4,11-二烯ZhangZR,LiaoZH,PengMF.CloningandfunctionalanalysesofHDSgenefromArtemisiaannua[J].ChinTraditHerbDrugs(中草藥),2012,43:148?154.Part2：青蒿素的生物合成主要包括四大步驟第一步是通過甲4青蒿素的生物合成主要包括四大步驟第三步是在紫穗槐-4,11-二烯氧化酶（AMO）的作用下,紫穗槐-4,11-二烯進一步被氧化形成青蒿醇、青蒿醛,進而合成青蒿酸和/或二氫青蒿酸第四步是青蒿酸和或二氫青蒿酸通過一系列酶反應(yīng)和或非酶反應(yīng)形成青蒿素由于從青蒿酸/二氫青蒿酸形成青蒿素的途徑不是很清楚,現(xiàn)在通過合成生物學技術(shù)制備青蒿素的研究絕大部分采用的都是一種半合成的路線。即通過代謝工程制備青蒿素的前體如紫穗槐-4,11-二烯、青蒿酸和二氫青蒿酸,然后通過半合成的方法合成青蒿素青蒿素的生物合成主要包括四大步驟第三步是在紫穗槐-4,5參與青蒿素合成的特異性酶基因紫穗槐-4,11-二烯氧化酶基因2006年,美國的Keasling從青蒿腺毛中克隆得到了紫穗槐-4,11-二烯氧化酶基因CYP71AV1。對底物具有特異性,只能作用于紫穗槐-4,11-二烯。醛脫氫酶基因2009年,Teoh等從青蒿中分離得到1個醛脫氫酶基因命名為Aldh1。ALDH1能作用于青蒿醛和二氫青蒿醛，生成相應(yīng)的青蒿酸和二氫青蒿酸。細胞色素P450還原酶基因CYP71AV1是一種P450氧化酶,其不能單獨發(fā)揮作用,必須由電子配偶體的配合。青蒿醛雙鍵還原酶基因2009年,Zhang等從青蒿中分離得到一個雙鍵還原酶,命名為Dbr。催化青蒿醛形成二氫青蒿醛,但產(chǎn)物以11S-二氫青蒿醛為主。參與青蒿素合成的特異性酶基因紫穗槐-4,11-二烯氧化酶基6Part3：合成生物學角度：

提高工程菌中目的產(chǎn)物產(chǎn)量的措施通過“開源”方式增加前體供應(yīng)通過“節(jié)流”方式增加前體供應(yīng)

提高底物利用效率

優(yōu)化培養(yǎng)和生產(chǎn)條件HanJL,LiZQ,YeHC,etal.Molecularcloning,prokaryoticexpression,andenzymeactivityassayoffpsfromArtemisiaannuastrain00l[J].JAgricUnivHebei(河北農(nóng)業(yè)大學學報),2008,31:71?75.Part3：合成生物學角度：

提高工程菌中目的產(chǎn)物產(chǎn)量的措73.1通過“開源”方式增加前體供應(yīng)WuW,YuanM,ZhangQ,etal.Chemotype-dependentmetabolicresponsetomethyljasmonateelicitationinArtemisiaannua[J].PlantaMed,2011,77:1048?1053.青蒿素是一種倍半萜,其生物合成包括兩部分。上游部分(toppathway)主要指倍半萜共同前體法尼基焦磷酸（FPP)的形成。通過MEP和MVA兩條途徑形成的FPP池可以為下游各種半萜以及甾提供前體物質(zhì)。下游部分(bottompathway)是青蒿素生物合成的特異途徑,即在ADS的競爭作用下,將上游途徑中形成的FPP池中的部分FPP引入青蒿素生物合成代謝流中。優(yōu)化措施：增加基因的拷貝數(shù)、啟動子修飾、密碼子優(yōu)化、基因替換、增加輔酶數(shù)量、優(yōu)化或平衡多基因控制的代謝途徑3.1通過“開源”方式增加前體供應(yīng)WuW,Yuan83.2通過“節(jié)流”方式增加前體供應(yīng)除了增加法尼基焦磷酸（FPP)的絕對供應(yīng)總量之外,減少FPP池中的前體流入其他倍半萜代謝途徑,促使相對更多的前體流入青蒿素及其中間體生物合成的特異途徑也是有效提高其產(chǎn)量的方法。

這些節(jié)流措施主要包括：抑制或下調(diào)競爭代謝途徑,從而限制或減少流入競爭代謝途徑中的FPP供應(yīng)。3.2通過“節(jié)流”方式增加前體供應(yīng)除了增加法尼基焦93.3提高底物利用效率提高青蒿素生物合成特異途徑中的途徑酶效率,主要通過兩種方式：提高單個基因效率和優(yōu)化平衡整條途徑來實現(xiàn)這個目的。對于單個基因效率的提高,：主要采取增加基因拷貝數(shù)、密碼子優(yōu)化、強啟動子調(diào)控和融合基因等方式。對于代謝途徑的平衡優(yōu)化：主要采用一種基于全局的數(shù)學算法和生物信息分析,如代謝流控制分析。相對于單個基因效率的提高,整條代途徑的平衡優(yōu)化顯得更為困難和復(fù)雜,對最終產(chǎn)物產(chǎn)量的影響也是最深刻和直接的。3.3提高底物利用效率提高青蒿素生物合成特異途徑中的103.4優(yōu)化培養(yǎng)和生產(chǎn)條件除了對青蒿素代謝途徑自身進行優(yōu)化外，培養(yǎng)條件對工程菌中青蒿素及其前體的產(chǎn)量也有相當大的影響。長期以來,以美國堪薩斯大學Weathers研究團隊為代表,通過添加植物激素、營養(yǎng)成分、光照、非生物脅迫刺激劑等試圖提高青蒿培養(yǎng)細胞的青蒿素含量。開展細胞培養(yǎng)并獲取高產(chǎn)青蒿素的技術(shù)仍然是一條漫長的路。FarhiM,MarhevkaE,Ben-AriJ,etal.Generationofthepotentanti-malarialdrugartemisininintobacco[J].NatBiotechnol,2011,29:1072?1074.3.4優(yōu)化培養(yǎng)和生產(chǎn)條件除了對青蒿素代謝途徑自身進11Part4：工業(yè)化研究進展

中國從上世紀80年代開始關(guān)注化學合成方法制造青蒿素。1984年年初，實現(xiàn)青蒿素的人工全合成。遺憾的是，該成果至今未能實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，而這也是此后幾乎所有青蒿素人工合成面臨的窘境。

可以說，人工合成之困，在于工業(yè)化；工業(yè)化之難，在于成本。到目前為止，已有的合成方法大部分實現(xiàn)不了工業(yè)化，而原因是合成路線中使用的化學試劑比較貴，或合成效率比較低。

在全球范圍內(nèi)，能實現(xiàn)人工合成青蒿素工業(yè)化生產(chǎn)的企業(yè)，只有法國賽諾菲公司。

國際上現(xiàn)在非常關(guān)注青蒿素的生物發(fā)酵生產(chǎn)。但是，生物發(fā)酵面臨的問題是，它只能生產(chǎn)出青蒿酸，從青蒿酸到青蒿素最后幾步的生產(chǎn)仍存在挑戰(zhàn)。人工合成青蒿素途徑

生物發(fā)酵化學合成Part4：工業(yè)化研究進展

中國從上世紀80年代開始關(guān)12Part4：工業(yè)化研究進展法國賽諾菲公司利用美國授權(quán)的酵母工程菌發(fā)酵生產(chǎn)青蒿酸，2012年年底已生產(chǎn)出39噸，轉(zhuǎn)化為青蒿素后相當于4000萬份抗瘧藥。然而，將青蒿酸“轉(zhuǎn)化為青蒿素抗瘧藥”遠非想象中的那么簡單。該公司僅僅建立了一條小型生產(chǎn)線。由于比黃花蒿植物提取方法成本高，其目的僅是為了平衡和穩(wěn)定市場，對植物提取進行補充，而非取代植物提取方法來生產(chǎn)青蒿素。Part4：工業(yè)化研究進展法國賽諾菲公司利用美國授13美國伯克利分校的Keasling課題組構(gòu)建了一個能制備紫穗槐-4，11-二烯的E.coli工程菌甲羥戊酸合成模塊(頂部模塊，topmodule)FPP合成模塊(底部模塊，bottommodule)紫穗槐-4，11-二烯合成模塊

這3個模塊都由一些可拆卸的即插即用的元件構(gòu)成，

因此，既可以方便地對模塊中的元件進行優(yōu)化，也能便捷地將這些模塊用于其他代謝途徑的構(gòu)建，將眾多復(fù)雜的生物合成途徑演變成了可隨時拆卸用的工程化生物系統(tǒng)。美國伯克利分校的Keasling課題組構(gòu)建了一個能制備紫穗槐14“中國神藥”的青蒿素

2015年的諾貝爾生理學或醫(yī)學獎，為中國原創(chuàng)新藥青蒿素戴上了光環(huán)。但這個被國人自豪地稱為“中國神藥”的青蒿素，也給中國帶來了些許壓力與困窘。

據(jù)報道，在全球青蒿素大宗公立采購市場上，50%的份額已被異軍突起的印度仿制藥集團搶走，歐洲制藥集團的市場份額迅速退守到不足30%，中國則縮減至5%以下。與此同時，中國卻是全球青蒿素生產(chǎn)原料的最大供應(yīng)國。

一邊，中國面臨的青蒿素供應(yīng)需求壓力長期存在；另一邊，市場份額日益縮減，而人工合成青蒿素工業(yè)化的路子又走不通。窘境之下，一批中國學家正在探索可工業(yè)化的人工合成方法，希望找到一條讓中國不只是“原料供應(yīng)國”的新路。“中國神藥”的青蒿素

2015年的諾貝爾生理學或醫(yī)15Part5：研究展望

通過合成生物學制備青蒿素及其中間體的成功，無論對青蒿素本身還是對未來天然藥物的生產(chǎn)格局都會產(chǎn)生深遠的影響。合成生物學工藝，能在短時間內(nèi)獲得大量的青蒿素，能穩(wěn)定世界市場上青蒿素的供應(yīng)，有效地降低青蒿素的價格，有利于控制瘧疾在貧困國家的肆虐。

合成生物學制備青蒿素對其他稀缺藥物的綠色制備具有借鑒意義，能有效地推動天然藥物的可持續(xù)發(fā)展、能引領(lǐng)其他天然藥物的綠色制備。青蒿素是醫(yī)藥界的“重磅炸彈”，通過合成生物學制備青素的成功，其意義可能不止每年幾十億元的銷售額。Part5：研究展望合成生物學制備青16參考文獻BouwmeesteraHJ,WallaartbTE,JanssenaMHA,etal.Amorpha-4,11-dienesynthasecatalysesthefirstprobablestepinartemisininbiosynthesis[J].Phytochemistry,1999,52:843?854.ZhangZR,LiaoZH,PengMF.CloningandfunctionalanalysesofHDSgenefromArtemisiaannua[J].ChinTraditHerbDrugs,2012,43:148?154.HanJL,LiZQ,YeHC,etal.Molecularcloning,prokaryoticexpression,andenzymeactivityassayoffpsfromArtemisiaannuastrain00l[J].JAgricUnivHebei,2008,31:71?75.WuW,