第二章基因工程基本原理課件

D基因工程的支撐技術(shù)第二章基因工程的基本原理C基因工程的基本原理B基因工程的分子生物學(xué)A重組DNA技術(shù)的理論基礎(chǔ)第一節(jié)基因工程的基本原理A重組DNA技術(shù)的理論基礎(chǔ)基因工程的基本原理19世紀(jì)中孟德爾

豌豆雜交試驗

遺傳因子經(jīng)典遺傳學(xué)20世紀(jì)初摩爾根

果蠅雜交實驗

基因基因?qū)W1944年艾弗瑞

肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗

遺傳物質(zhì)DNA1973年伯格-杰克森-考恩-鮑耶

DNA分子體外拼接分子遺傳學(xué)1953年沃森-克瑞克

DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)分子生物學(xué)基因工程B基因的分子生物學(xué)基因工程的基本原理C基因工程的基本原理基因工程的基本原理提高外源基因的劑量——分子遺傳學(xué)原理篩選修飾重組基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，如：啟動子、

增強子、操作子、終止子、上游調(diào)控序列等列、mRNA非編碼區(qū)、密碼子等——分子生物學(xué)原理

修飾構(gòu)建蛋白質(zhì)生物合成的翻譯調(diào)控元件，如：SD序

基因工程菌（微型生物反應(yīng)器）的增殖及穩(wěn)定生產(chǎn)——生化工程學(xué)原理

——分子生物學(xué)原理

D基因工程的支撐技術(shù)基因工程的基本原理核酸凝膠電泳技術(shù)核酸分子雜交技術(shù)細(xì)菌轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)染技術(shù)DNA序列分析技術(shù)寡核苷酸合成技術(shù)基因定點突變技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)

2.1

核酸的結(jié)構(gòu)與功能2.2

基因與基因組2.3

中心法則與基因表達(dá)調(diào)控2.4

自然界的基因轉(zhuǎn)移和重組第二節(jié)基因工程的分子生物學(xué)基礎(chǔ)

2.1

核酸的結(jié)構(gòu)與功能核酸：就是由許多核苷酸按照一定的順序連接所組成的多核苷酸，它的主要功能是充當(dāng)遺傳信息的載體。

脫氧核糖核酸:DNA

核糖核酸:RNA戊糖堿基核苷酸的基本組成DNA的一級結(jié)構(gòu)與功能結(jié)構(gòu)式DNA的結(jié)構(gòu)和功能DNA的二級結(jié)構(gòu)與功能1螺旋直徑2nm2鏈間有螺旋形凹槽，較小的為小溝（1.2

nm），較大的為大溝（2.2nm）3堿基間距為0.34nm4結(jié)構(gòu)重復(fù)周期3.4nm5每輪堿基數(shù)為106堿基平面與縱軸垂直。

RNA的結(jié)構(gòu)與功能

信使RNA（messenger

RNA，mRNA）核糖體RNA（ribosomal

RNA，rRNA）轉(zhuǎn)運RNA（transfer

RNA，tRNA）mRNA1.mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯發(fā)生在同一個細(xì)胞空間，這兩個過程幾乎是同步進行的。2.半衰期短。3.許多原核生物mRNA以多順反子的形式存在。4.原核生物mRNA的5’端無帽子結(jié)構(gòu)，3’端沒有或只有較短的多聚（A）結(jié)構(gòu)。5.原核生物常以AUG（有時GUG，甚至UUG）作為起始密碼子

真核細(xì)胞mRNA的合成和功能表達(dá)發(fā)生在不同的空間和時間范疇內(nèi)。

單順反子形式存在。5’端存在“帽子”結(jié)構(gòu)。絕大多數(shù)具有多聚(A)尾巴。真核生物幾乎永遠(yuǎn)以AUG作為起始密碼子。

rRNA49種蛋白質(zhì)60S亞基28S

rRNA5.8S

rRNA5S

rRNA40S亞基18S

rRNA33種蛋白質(zhì)50S亞基23S

rRNA5S

rRNA36種蛋白質(zhì)30S亞基16s

rRNA21種蛋白質(zhì)高等動物核糖體（80S）E.coli核糖體（70S）tRNA二級結(jié)構(gòu)

三級結(jié)構(gòu)

核酸的理化性質(zhì)及其應(yīng)用

一般理化性質(zhì)

DNA為白色纖維狀固體

RNA為白色粉末狀固體

紫外吸收：260nmA260/

A280值可以反映核酸的純度。純的DNA：A260/

A280

=1.8純的RNA：A260/

A280

=2.0DNA變性

在某些理化因素下，DNA分子互補堿基之間的氫鍵斷裂，致使DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)松開，變成單鏈，即為DNA變性（denaturation）。引起變性的因素有：加熱、酸堿、尿素、甲醛等。

核酸變性后，在260nm處的吸收值上升，這叫增色效

應(yīng)(hyperchromic

effect)。增色效應(yīng)?？捎脕砗饬緿NA變性的程度。核酸的理化性質(zhì)

熱變性中光吸收達(dá)到最大吸收（完全變性）一半（雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半）時的溫度稱為DNA的熔點或熔解溫度（Tm）。DNA變性熱變性曲線(熔解曲線)在DNA發(fā)生熱變性的過程中，A260隨溫度的變化曲線影響Tm值的因素?

變性DNA在適當(dāng)條件下，兩條互補鏈可重新恢復(fù)為天然的雙螺旋結(jié)構(gòu)，這種現(xiàn)象稱為復(fù)性（renaturation）。DNA單鏈之間、一條DNA和一條RNA鏈之間主要存在序列互補配對區(qū)域，不管是整條鏈互補，還是部分序列互補，均可能重新形成整條雙鏈或部分雙鏈，這即為核酸分子雜交（hybridization）。復(fù)性和雜交

2.2

基因與基因組基因的結(jié)構(gòu)基因（gene）：能夠編碼一段多肽或功能RNA的一段核苷酸序列?；虻幕咎匦裕夯蚩勺晕覐?fù)制基因決定性狀基因可以突變基因的分類：結(jié)構(gòu)基因調(diào)控基因

原核生物基因結(jié)構(gòu)

——

操縱子(operon)

機制

其他調(diào)節(jié)序列

編碼序列(promoter)

操縱序列(operator)

啟動序列

真核生物基因結(jié)構(gòu)

真核生物的結(jié)構(gòu)基因不僅在兩側(cè)有非編碼區(qū)，而且在基因內(nèi)部也有許多不編碼蛋白質(zhì)的間隔序列，即內(nèi)含子（intron），編碼區(qū)則成為外顯子（exon）。終止子（terminator）基因結(jié)構(gòu)中能夠促進轉(zhuǎn)錄終止的DNA序列，在RNA水平上通過轉(zhuǎn)錄出的終止子序列形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)而終止。

基因組

原核生物的基因組基因組小多順反子mRNA非編碼區(qū)少基因重疊不含內(nèi)含子基因組（genome）：單倍體細(xì)胞中的全套染色體上所有基因的總和。真核生物基因組同源基因組基因組大單順反子重復(fù)序列非編碼序列90%以上基因家族轉(zhuǎn)座子/逆轉(zhuǎn)座子

2.3

中心法則與基因表達(dá)調(diào)控

生物信息的傳遞原核生物基因的表達(dá)調(diào)控真核生物基因的表達(dá)調(diào)控2.3.1

生物信息的傳遞?復(fù)制的起始(initiation)?DNA鏈的延伸(elongation)?復(fù)制的終止(termination)DNA復(fù)制的基本過程轉(zhuǎn)錄的基本過程

模板識別(TemplateRecognition)

轉(zhuǎn)錄起始(Initiation)

轉(zhuǎn)錄的延伸(Elongation)

轉(zhuǎn)錄的終止

(Termination)蛋白質(zhì)的生物合成?????氨基酸活化肽鏈的起始肽鏈的延伸肽鏈的終止新合成多肽鏈的折疊和加工

轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控mRNA加工成熟水平上的調(diào)控翻譯水平上的調(diào)控2.3.2

基因的表達(dá)調(diào)控32lacI調(diào)節(jié)基因lacZlacYlacADNAmRNAβ

-GalactosidasePermeaseTransacetylaseProtein結(jié)構(gòu)基因PlacIPlacOlacTheLACoperon原核生物基因的表達(dá)調(diào)控①阻遏蛋白的負(fù)調(diào)控調(diào)控基因②CAP正調(diào)控真核生物基因的表達(dá)調(diào)控DNA水平的調(diào)控轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控(transcriptional

regulation)轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控(post

transcriptional

regulation)翻譯水平的調(diào)控(translational

regulation)翻譯后水平的調(diào)控(protein

maturation)真核生物基因表達(dá)調(diào)控的特點和種類真核生物DNA水平上的基因表達(dá)調(diào)控

真核生物轉(zhuǎn)錄水平上的基因表達(dá)調(diào)控順式作用元件和反式作用因子真核基因他水平上的調(diào)控

RNA的加工成熟、翻譯水平的調(diào)控、翻譯后水平的調(diào)控基因丟失基因擴增基因重排DNA甲基化狀態(tài)與調(diào)控染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與調(diào)控DNaseI超敏感位點基因座控制區(qū)（LCR）核基質(zhì)結(jié)合區(qū)（MAR）

2.4

自然界的基因轉(zhuǎn)移和重組接合作用

細(xì)菌之間通過菌毛相互接觸時，質(zhì)粒便可從一個細(xì)胞轉(zhuǎn)移至另一細(xì)胞，這種類型的DNA轉(zhuǎn)移稱為接合作用（conjugation）

。

轉(zhuǎn)化作用（transfromation）通過自動獲取或人為地供給外源DNA，使細(xì)胞或培養(yǎng)的受體細(xì)胞獲得新的遺傳表型。轉(zhuǎn)導(dǎo)作用（transduction）當(dāng)病毒從被感染的（供體）細(xì)胞釋放出來再次感染另一（受體）細(xì)胞時，發(fā)生在供體細(xì)胞與受體細(xì)胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組方式。轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)導(dǎo)溶菌途徑溶源途徑噬菌體感染宿主的結(jié)果:第三節(jié)基因工程的支撐技術(shù)核酸凝膠電泳技術(shù)核酸分子雜交技術(shù)細(xì)菌轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)染技術(shù)DNA序列分析技術(shù)寡核苷酸合成技術(shù)基因定點突變技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)基本原理

(PCR—PolymeraseChainReaction聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))

一個DNA經(jīng)n次擴增后,一個DNA分子可變?yōu)?n個分子DNA擴增需要對待擴增的DNA序列有所了解，至少要對其兩側(cè)的核苷酸序列為已知，以便合成寡核苷酸引物。PCR技術(shù)反應(yīng)體系DNA模板；dNTPs；+Tris·HCl緩沖液；引物；DNA聚合酶循環(huán)90℃變性30″；50℃退火30″；75℃延伸1′；進入第N次循環(huán)。PCR原理示意圖錨定PCR（AnchoredPCR，A-PCR）或稱RACEPCR種類反向PCR（inversePCR）

該法可用于擴增已知序列兩側(cè)的未知序列反轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscriptionPCR,RT-PCR)

主要用于mRNA的PCR擴增RT-PCR有時候也會指代實時PCR(real-time

PCR)。為了與逆轉(zhuǎn)錄PCR相區(qū)別，通常被寫作“定量PCR”(quantitative

PCR)或者RTQ-PCR(real-time

quantitative

PCR)。實時PCR(real-time

PCR)，屬于定量PCR（Q-PCR）的一種，以一定時間內(nèi)DNA的增幅量為基礎(chǔ)進行DNA的定量分析。定量PCR（Q-PCR）還有半定量semiquantitative

PCR。real

time

PCR

的定量使用螢光色素，目前有二種方法。一種是在ds

DNA中插入特異的螢光色素；另一種使用一種能與增幅DNA序列中特定寡核酸序列相結(jié)合的一種螢光探針（probe）。實時熒光定量PCR（Real-timePCR）熒光定量PCR所使用的熒光化學(xué)可分為兩種：熒光探針和熒光染料。TaqMan熒光探針：PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。SYBR熒光染料：加端PCR（Add-onPCR）在合成引物時加上研究者所需要的核苷酸序列：如某種限制酶的識別序列，某一基因的調(diào)控或其它必需序列錯配PCR（mismatchedPCR)利用該法可在一已知DNA序列中引起點突變，缺失突變和插入突變。重組PCR（RecombinantPCR）利用該法可將不同基因的DNA片段連接在一起。分子雜交技術(shù)按其分子種類劃分DNA雜交

探針為DNA或RNA

RNA雜交

探針為DNA或cDNA蛋白質(zhì)免疫分析

探針為抗體原位雜交(insituhybridization)

i.原位菌落雜交

ii.原位噬菌斑雜交

iii.原位細(xì)胞雜交

iv.原位組織塊雜交斑點雜交(dothybridization)

先分離DNA，RNA或蛋白質(zhì)，然后將樣品液直接點在固體基質(zhì)上進行雜交，不能測定分子量大小。按其樣品制備劃分轉(zhuǎn)移雜交或印跡雜交(blottinghybridization)

先純化樣品，然后使不同大小的分子在凝膠上分離，轉(zhuǎn)移到固體基質(zhì)上，與探針雜交。該法可檢測出感興趣分子的分子量。用于轉(zhuǎn)移的方法有：

i.擴散法

ii.毛細(xì)管法

iii.電泳轉(zhuǎn)移法

iv.真空轉(zhuǎn)移法夾心雜交法(sandwichhybridization)它利用兩種探針與待測DNA結(jié)合，先將不帶標(biāo)記的探針固定在基質(zhì)上，然后用待測樣品與之雜交，洗去非特異性結(jié)合后，再與第二種帶標(biāo)記的探針雜交。這種方法可用于粗制DNA樣品，可檢測出0.2ng的DNA樣品分子雜交的一般程序DNA和RNA的雜交

制備DNA或RNA樣品；與固定基質(zhì)結(jié)合；80℃真空固定；預(yù)雜交；加入標(biāo)記探針雜交；洗滌；放射自顯影或顯色反應(yīng)。

蛋白質(zhì)的免疫分析制備蛋白質(zhì)樣品與固定基質(zhì)結(jié)合；常溫空氣中固定；封閉劑封閉；一抗反應(yīng)；洗滌；二抗-酶偶聯(lián)物反應(yīng)；洗滌；顯色反應(yīng)（EIA）；或→一抗放射標(biāo)記物→洗滌→放射自顯影（RIA）探針的制備32P，3H，35S 用于核酸標(biāo)記，其中32P和35S使用頻率高。32P標(biāo)記核苷酸的α位或γ位，35S則是標(biāo)記核苷酸的α位；125I，3H，14C用于蛋白質(zhì)標(biāo)記。放射性同位素標(biāo)記物非放射性標(biāo)記物半抗原包括地高辛配體，汞，2-乙酰胺二苯丙茂和金屬銪。地高辛配體是一種脂質(zhì)半抗原，可將其連在dUTP上，然后用酶將其摻入新合成鏈中。檢測上述標(biāo)記物的方法是利用二抗-酶偶聯(lián)物反應(yīng)和顯色反應(yīng)。生物素核酸探針是與基因部分互補的一短的DNA或RNA堿基序列，核酸探針可以與基因雜交。標(biāo)記探針的制備鏈標(biāo)記法

i.切口移位法

ds-DNA+DNaseI+DNApolI+dNTP(32P-dCTP)ii.隨機