南師大細(xì)胞生物學(xué) 考研課件 第3章+細(xì)胞生物學(xué)研究方法

第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法1．細(xì)胞形態(tài)的結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)的觀察方法2．細(xì)胞及其組分的分離、顯示鑒定及定量技術(shù)3．細(xì)胞體外操縱技術(shù)知識(shí)點(diǎn)：第一節(jié)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和觀察方法細(xì)胞的形態(tài)觀察

細(xì)胞的大小和計(jì)量單位鴕鳥卵=12-15cm人卵細(xì)胞=0.1mm多數(shù)細(xì)胞=10-30μm血細(xì)胞=7μm

顯微鏡觀察范圍

肉眼觀察范圍顯微鏡觀察范圍&肉眼觀察范圍細(xì)胞生物學(xué)及成像技術(shù)發(fā)展史17世紀(jì)中葉的滑竿顯微鏡荷蘭眼鏡商詹ZacchariasJanssen制造的第一臺(tái)復(fù)合式顯微鏡

RobertHooke于1670年制造的顯微鏡現(xiàn)代顯微鏡?簡(jiǎn)潔緊湊的設(shè)計(jì)節(jié)省了鏡座占用空間

?人機(jī)工程學(xué)設(shè)計(jì)，操作簡(jiǎn)單

?方便地安裝各種CCD數(shù)碼成像裝置

?出色的光學(xué)性能與系統(tǒng)的優(yōu)良品質(zhì)?

?最新的UIS2光學(xué)系統(tǒng)賦予顯微圖像前所未有的優(yōu)異對(duì)比度價(jià)格：幾萬(wàn)至幾十萬(wàn)元?。∫?光學(xué)顯微鏡技術(shù)體式光學(xué)顯微鏡光學(xué)顯微鏡（一）普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡技術(shù)

目鏡

光學(xué)放大系統(tǒng)

物鏡

光源1.組成

照明系統(tǒng)

折光鏡

聚光鏡

機(jī)械和支架系統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的成像原理使用兩個(gè)凸透鏡，一個(gè)凸透鏡把另外一個(gè)所成的像進(jìn)一步放大，這就是復(fù)合式顯微鏡的基本原理。如果兩個(gè)凸透鏡一個(gè)能放大10倍，另一個(gè)能放大20倍，那么整個(gè)鏡片組合的放大倍數(shù)就是10×20=200倍。復(fù)合顯微鏡中通常有兩級(jí)串聯(lián)放大系統(tǒng)，一級(jí)為物鏡，另一級(jí)為目鏡。2.分辨率：能夠區(qū)別開(kāi)的兩個(gè)物點(diǎn)之間的距離

0.61λD=N.Sin(

/2)

最大分辨率=0.2μm

N=1,λmin=450nm,

=140→D=0.3um3.制樣方法

固定、脫水、包埋、切片、染色、觀察正置光學(xué)顯微鏡倒置顯微鏡光路系統(tǒng)正置顯微鏡與倒置顯微鏡光路比較（二）熒光顯微技術(shù)什么是熒光?物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時(shí)釋放出的光，是非溫度輻射光——冷光。即：物質(zhì)吸收短波光，發(fā)射出的長(zhǎng)波光。顯微鏡熒光利用光源激發(fā)——光化熒光Specimenabsorbslightatonewavelength(theexcitationwavelength)andemitslight(fluoresces)ataspecificandlongerwavelength.Mostfluorescentdyesemitvisiblelight.

將試劑抗原或試劑抗體用熒光素進(jìn)行標(biāo)記，試劑與標(biāo)本中相應(yīng)的抗體或抗原反應(yīng)后，測(cè)定復(fù)合物中的熒光素，這種免疫技術(shù)，稱為免疫熒光素技術(shù)。

免疫熒光技術(shù)RevealingSpecificProteinsinFixedCells

RevealingSpecificProteinsinLivingCellsDeterminingtheIntracellularConcentrationofCa2+andH+Ions

Thefluorescentpropertiesofcertaindyes,suchasfura-2,facilitatemeasurementoftheconcentrationoffreeCa2+inthecytosol.（三）激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)價(jià)格：幾百萬(wàn)元?。?！傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡使用的是場(chǎng)光源，標(biāo)本上每一點(diǎn)的圖像都會(huì)受到鄰近點(diǎn)的衍射或散射光的干擾；激光掃描共聚焦顯微鏡利用激光束經(jīng)照明針孔形成點(diǎn)光源對(duì)標(biāo)本內(nèi)焦平面的每一點(diǎn)掃描，標(biāo)本上的被照射點(diǎn)，在探測(cè)針孔處成像，由探測(cè)針孔后的光點(diǎn)倍增管（PMT）或冷電耦器件（cCCD）逐點(diǎn)或逐線接收，迅速在計(jì)算機(jī)監(jiān)視器屏幕上形成熒光圖像。照明針孔與探測(cè)針孔相對(duì)于物鏡焦平面是共軛的，焦平面上的點(diǎn)同時(shí)聚焦于照明針孔和發(fā)射針孔，焦平面以外的點(diǎn)不會(huì)在探測(cè)針孔處成像，這樣得到的共聚焦圖像是標(biāo)本的光學(xué)橫斷面，克服了普通顯微鏡圖像模糊的缺點(diǎn)。

基本原理激光掃描共聚焦成像系統(tǒng)共聚焦顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)用激光作光源，逐點(diǎn)、逐行、逐面快速掃描。能顯示細(xì)胞樣品的立體結(jié)構(gòu)。分辨力是普通光學(xué)顯微鏡的3倍。用途類似熒光顯微鏡，但能掃描不同層次，形成立體圖像。FluorescentMicroscopeObjectiveArcLampEmissionFilterExcitationDiaphragmOcularExcitationFilterObjectiveLaserEmissionPinholeExcitationPinholePMTEmissionFilterExcitationFilterConfocalMicroscope3DImageReconstructionzxyzxyzyy3DImageReconstructionxyzyyz3DImageReconstruction.IsletofLangerhansTriplelabelledisletofLangerhansextractedfromPancreas.LabelledwithFITC-anti-isnsulin(green),CY3-ant-somatostatin(red)andCY5-anti-glucagon(blue)..MouseOocytes-calcium.DemonstratesnuclearCalciumfluctuationsinmouseoocytesattheonsetofmeioticresumption.NuCagreen(MolProbesInc)hasbeenusedastheCalciumprobe.t3colourprojectionof18opticalsectionsthroughalivingleaf.Visualisedbyauto-fluorescentLCSMImageofaXenopusMelanophoremicrotubulecytoskeleton(green)andthenucleus(blue)/（四）數(shù)字成像顯微技術(shù)攝像機(jī)隨機(jī)攝取同一區(qū)域的多幅圖象，信號(hào)通過(guò)計(jì)算機(jī)放大，多幅圖相加并平均，使信號(hào)反差增強(qiáng)。圖象數(shù)字化處理技術(shù)提高信/噪比Anexampleoftheimagesproducedbytoday'simprovedmicroscopesispresentedinFigure1,whichillustratesadigitallycapturedmulticolorfluorescenceimageoftissueculturecellstakenonanEclipseE600microscopeusingtheCFI6040×fluoriteobjectiveandNikon'snewDXM1200digitalcamera.

暗視野顯微鏡（darkfieldmicroscope）的聚光鏡中央有擋光片，使照明光線不直接進(jìn)入物鏡，只允許被標(biāo)本反射和衍射的光線進(jìn)入物鏡，因而視野的背景是黑的，物體的邊緣是亮的。利用這種顯微鏡能見(jiàn)到小至4-200nm的微粒子，分辨率可比普通顯微鏡高50倍。（五）暗場(chǎng)顯微技術(shù)

DarkfieldMicroscopyDictydiumcancellatumThephotomicrographbelowillustratestheslimemoldfungusDictydium

cancellatumunderdarkfieldillumination,imagedwitha10×objectiveonaNikonOptiphotmicroscope.（六）、相差顯微鏡

相差顯微鏡（phasecontrastmicroscope）由P．Zernike于1932年發(fā)明，并因此獲1953年諾貝爾物理獎(jiǎng)。這種顯微鏡最大的特點(diǎn)是可以觀察未經(jīng)染色的標(biāo)本和活細(xì)胞。相差顯微鏡的基本原理是，把透過(guò)標(biāo)本的可見(jiàn)光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對(duì)比度，使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見(jiàn)。光線透過(guò)標(biāo)本后發(fā)生折射，偏離了原來(lái)的光路，同時(shí)被延遲了1/4λ（波長(zhǎng)），如果再增加或減少1/4λ，則光程差變?yōu)?/2λ，兩束光合軸后干涉加強(qiáng)，振幅增大或減下，提高反差。在構(gòu)造上，相差顯微鏡有不同于普通光學(xué)顯微鏡兩個(gè)特殊之處：1.環(huán)形光闌（annulardiaphragm）位于光源與聚光器之間，作用是使透過(guò)聚光器的光線形成空心光錐，焦聚到標(biāo)本上。2.相位板（annularphaseplate）在物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ。分為兩種：√A+相板：將直射光推遲1/4λ，兩組光波合軸后光波相加，振幅加大，標(biāo)本結(jié)構(gòu)比周圍介質(zhì)更加變亮，形成亮反差（或稱負(fù)反差）?！藼+相板：將衍射光推遲1/4λ，兩組光線合軸后光波相減，振幅變小，形成暗反差（或稱正反差），結(jié)構(gòu)比周圍介質(zhì)更加變暗。圖2-6相差顯微鏡照明原理圖2-7一種介殼蟲的染色體（PCM照片）（七）、微分干涉差顯微鏡

1952年，Nomarski在相差顯微鏡原理的基礎(chǔ)上發(fā)明了微分干涉差顯微鏡(differentialinterferencecontrast(DIC)microscope)，其優(yōu)點(diǎn)是能顯示結(jié)構(gòu)的三維立體投影影像。與相差顯微鏡相比，其標(biāo)本可略厚一點(diǎn)，折射率差別更大，故影像的立體感更強(qiáng)。調(diào)節(jié)DIC滑行器可使標(biāo)本的細(xì)微結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出正或負(fù)的投影形象，通常是一側(cè)亮，而另一側(cè)暗，這便造成了標(biāo)本的人為三維立體感，類似大理石上的浮雕。DIC顯微鏡使細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)，特別是一些較大的細(xì)胞器，如核、線粒體等，立體感特別強(qiáng)，適合于顯微操作。目前像基因注入、核移植、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等生物工程的顯微操作常在這種顯微鏡下進(jìn)行。Fig.1-2:Afibroblastintissueculturevisualizedwithfourtypesoflightmicroscopy.Theimagein(A)wasobtainedbythesimpletransmissionoflightthroughthecell,atechniqueknownasbright-fieldmicroscopy.(B)Phase-contrastmicroscopy;(C)DICmicroscopy;and(D)dark-fieldmicroscopy.四種觀察方式比較（七）錄像增加反差顯微技術(shù)錄像機(jī)+圖象處理技術(shù)高度光敏感攝像機(jī)獲取信號(hào)可以數(shù)字化后輸入計(jì)算機(jī)計(jì)算機(jī)彌補(bǔ)光學(xué)系統(tǒng)的缺點(diǎn)而達(dá)到理論上的分辨率0.61λ

分辨率

D=N=1,Sin180/2=1

N.Sin(

/2)

λ越小分辨率越高

人們尋找更短波長(zhǎng)的照明物質(zhì)以提高分辨率

光學(xué)顯微鏡的分辨率在理論上不能小于0.2nm,這是因?yàn)槭芄獠úㄩL(zhǎng)的局限,即可見(jiàn)光的波長(zhǎng)不能小400nm。

電鏡是利用電子束對(duì)樣品放大成像的顯微鏡，電子束波長(zhǎng)為0.01-0.9nm，因而分辨率大大提高。二、電子顯微鏡技術(shù)（一）電子顯微鏡的基本知識(shí)1.電子顯微鏡的分辨本領(lǐng)與有效放大倍數(shù)分辨本領(lǐng)：電鏡在最佳狀態(tài)下的分辨率可達(dá)0.2nm放大倍數(shù)：電鏡比光鏡觀察到更加細(xì)微的結(jié)構(gòu)，主要是因?yàn)殡婄R具有更高的分辨率而不是通常所說(shuō)的放大倍數(shù)高。2.電鏡與光鏡的基本區(qū)別

光鏡電鏡光源可見(jiàn)光（300-700nm）

電子束紫外光（200nm）分辨率

100-200nm0.1nm透鏡玻璃透鏡磁透鏡真空無(wú)要求1.33×10-3—10-5PaTEM3.電鏡的基本構(gòu)造電子照明系統(tǒng)電子槍（高頻電流加熱鎢絲發(fā)出電子）聚光鏡（靜電透鏡）—匯聚電子束電磁透鏡成像系統(tǒng)物鏡、中間鏡、放大鏡真空系統(tǒng)保持電子槍、鏡筒和記錄系統(tǒng)的高真空記錄系統(tǒng)

熒光屏和感光膠片電源系統(tǒng)

供給高壓、恒電電壓和電流電鏡的類型透射電鏡TEM（TransmissionElectronMicroscope）內(nèi)部結(jié)構(gòu)觀察掃描電鏡SEM（ScanningElectronMicroscope）外部形態(tài)觀察掃描透射電鏡STEM（ScanningTransmissionElectronMicroscope）外部形態(tài)及內(nèi)部結(jié)構(gòu)觀察超高壓透射電鏡

（Ultra-voltageTransmissionElectronMicroscope）活體觀察掃描電鏡結(jié)構(gòu)和原理

掃描電鏡利用從塊狀樣品表面收集到的信號(hào)電子成像,因此相當(dāng)于一種“反射式”顯微鏡(個(gè)別情況下也可采用透射模式)。ThismoldwasgrowingonablockofRomanocheeseinmyrefrigerator.Itwasbluishgreen,andisprobablyaPenicillum.Thepartsofmoldyouusuallyseearethereproductivestructures;thehyphaeunderneaththemarethepartsthatfeedonwhateverit'sgrowingon.Inthispicturetheyellowpartsarecalledconidiophores,andthegreensporesarecalledconidiaUnstainedbacteriophageT4.Afreeze-driedpreparationofbacteriophageT4andTMV.Thevirusconsistsofahead(normallyfullofdouble-strandedDNA),atailtube,abaseplateattheendofthetailtubeandthintailfibersattachedtothebaseplate.TheparticleatthelowerrighthaslostitsDNA.Themassperunitlengthofatailfiberis866+/-76kDa,indicatingitisatrimer.Thefull-scaleofthedark-fieldmicrographis0.512microns.（二）主要電鏡技術(shù)介紹生物樣品電鏡技術(shù)的特殊要求樣品薄ultrathinsection精細(xì)結(jié)構(gòu)好fixation具反差staining主要電鏡技術(shù)1.

超薄切片技術(shù)2.

負(fù)染技術(shù)3.

冰凍電鏡技術(shù)4.

金屬投影技術(shù)5.

冰凍斷裂和冰凍蝕刻電鏡技術(shù)6.

暗場(chǎng)電鏡技術(shù)7.

整裝細(xì)胞電鏡技術(shù)8.

包埋—去包埋劑超薄切片電鏡技術(shù)9.

高分辨率電鏡技術(shù)10.

掃描電鏡技術(shù)1.超薄切片技術(shù)

固定包埋切片染色觀察2.負(fù)染技術(shù)重金屬鹽包埋Electronmicrographofnegativelystained'synthetic'actinfilaments.Actinfilamentsaredouble-helicalpolymersconsistingoftwolinearstrandsof42-kDactinsubunitsthatarehelicallytwistedaroundeachother.Theinsetrevealsa3-Dvolume-renderedrepresentationofafilament3-Dreconstruction.負(fù)染就是用重金屬鹽如磷鎢酸或醋酸雙氧鈾對(duì)鋪展在載網(wǎng)上的樣品進(jìn)行染色；吸去染料，樣品干燥后，樣品凹陷處鋪了一薄層重金屬鹽，而凸的出地方則沒(méi)有染料沉積，從而出現(xiàn)負(fù)染效果，分辨力可達(dá)1.5nm左右SeveraloftheTbacteriophageviruses3.冰凍電鏡技術(shù)

避免化學(xué)固定劑、包埋劑等有機(jī)溶劑的影響，最大限度地保持樣品真實(shí)性Fig.1-7:Traditionalthinsectionofaculturedfibroblastthatwasquick-frozenbyslammingitontoaliquidhelium-cooledcopperblock,andthenfreeze-substituted.Withinthe'stressfibers'(SF;seealsoFig.1-3),individualactinfilaments(seealsoFig.8)areclearlyresolved.Theunaggregated,widerfilaments(MT)aremicrotubules,andthesmalldarkparticles(R)representribosomes4.金屬投影技術(shù)鉑、鈀、鉻等在真空中加熱蒸發(fā)Fig.1-9:Electronmicrographofamixtureofmyosinandnuclearlamin(L)dimersafterglycerolspraying/rotarymetalshadowingwithplatinum.Bothmoleculesarecomposedoftwoglobularheadslinkedtoacommonrod-liketail,approximately100nmlonginthecaseofmyosinand52nminthecaseofnuclearlamin.Fig.1-12:Surfacetopographyofmetal-coatedbacteriophageT4polyheadsrecordedbySTM(a,c)andbyTEM(b,d).Rawdata,topographrecordedintheSTM(a),andshadowgraphintheTEM(b).Surfacereliefs(c,d)computed(c)fromSTMtopographin(a),and(d)fromTEMshadowgraphin(b).5.冰凍斷裂和冰凍蝕刻電鏡技術(shù)冰凍蝕刻

冰凍蝕刻（freeze-etching）亦稱冰凍斷裂（freeze-fracture）。標(biāo)本置于-100度的干冰或-196度的液氮中，進(jìn)行冰凍。然后用冷刀驟然將標(biāo)本斷開(kāi)，升溫后，冰在真空條件下迅即升華，暴露出了斷裂面的結(jié)構(gòu)。冰升華暴露出標(biāo)本內(nèi)部結(jié)構(gòu)的步驟稱為蝕刻（etching）。蝕刻后，再向斷裂面上噴涂一層蒸汽碳和鉑。然后將組織溶掉，把碳和鉑的膜剝下來(lái)，此膜即為復(fù)膜（replica）。復(fù)膜顯示出了標(biāo)本蝕刻面的形態(tài)，可置于電鏡下觀察。電鏡下的影像即代表標(biāo)本中細(xì)胞斷裂面處的結(jié)構(gòu)。ABC透射電鏡照片與冰凍斷裂和冰凍蝕刻電鏡照片比較三、掃描隧道顯微鏡利用量子力學(xué)中的隧道效應(yīng)，當(dāng)原子尺度的針尖在不到1納米的高度上掃描樣品表面時(shí)，針尖與樣品之間產(chǎn)生隧道效應(yīng)，并且隧道電流(I)與針尖、樣品間距(d)有一指數(shù)關(guān)系，這樣d轉(zhuǎn)化為I的函數(shù)可以測(cè)定，針尖的位置就可以測(cè)定，由此樣品的表面形貌可以測(cè)定。Figure1-3.Comparisonofconstant-height

andconstant-currentmodeforSTMFigure1-2.SchematicoftipandsampleinteractionHereisaSTMimageshowingironatoms(Fe)adsorbonacopper(111)surfaceforminga“quantumcorral”inaverylowtemperature(4K).Actually,theimageshowsthecontourofthelocaldensityofelectronstates.Thecorralisabout14.3nmindiameter.原子力顯微鏡

ATOMICFORCEMICROSCOPY一種利用原子與分子間的相互作用力來(lái)觀察物體表面微觀形貌的新型實(shí)驗(yàn)技術(shù)。它有一根納米級(jí)的探針，被固定在可靈敏操控的微米級(jí)彈性懸臂上。當(dāng)探針很靠近樣品時(shí)，其頂端的原子與樣品表面原子間的作用力會(huì)使懸臂彎曲，偏離原來(lái)的位置。根據(jù)掃描樣品時(shí)探針的偏離量或振動(dòng)頻率重建三維圖像，就能間接獲得樣品表面的形貌或原子成分。

基本原理·提供真正的三維表面圖·不需要對(duì)樣品的任何特殊處理·在常壓下甚至在液體環(huán)境下都可以良好工作

OneoftheadvantagesofAFMisthatitcanimagethenon-conductingsurfaces.Soitwasimmediatelyextendedtothebiologicalsystems,suchasanalyzingthecrystalsofaminoacidsandorganicmonolayers.第二節(jié)細(xì)胞組分的分析方法一.細(xì)胞及細(xì)胞組分的分離與純化（一）細(xì)胞的分離技術(shù)1.破壞細(xì)胞外基質(zhì)及細(xì)胞連接（蛋白水解酶和EDTA）2.從混合細(xì)胞群體中分離出不同類型細(xì)胞物理（沉降、離心/粘附能力）免疫（耦聯(lián)材料：膠原、多糖小珠或塑料）熒光染料耦聯(lián)抗體標(biāo)記，流式分選（二）超離心技術(shù)細(xì)胞群體細(xì)胞崩解（低滲、超聲粉碎、強(qiáng)制過(guò)濾或研磨）差速離心亞細(xì)胞組分和各種顆粒細(xì)胞內(nèi)組分分離（三）細(xì)胞的選擇性抽提化學(xué)抽提法選擇性地抽提細(xì)胞的某些成分如：研究細(xì)胞骨架Cell

Triton等非離子去垢劑抽掉CM+可溶性成分骨架蛋白質(zhì)體系進(jìn)一步抽提核骨架-核纖層-中間纖維體系

蛋白酶消化蛋白質(zhì)核骨架+DNA

（四）柱層析技術(shù)和電泳技術(shù)分析蛋白質(zhì)與核酸分子可溶性細(xì)胞提取液中的蛋白質(zhì)可用柱層析方法純化蛋白質(zhì)

分子量帶電性分子親和性蛋白分子量和亞基組成可用SDS(十二烷基磺酸鈉）-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)測(cè)定分子量較大的不同核酸序列用瓊脂糖凝膠電泳分析分離二.細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、酶、糖、脂等的顯示方法

DNA

Feulgen反應(yīng)Shiff’s試劑紫紅色多糖

PAS反應(yīng)Shiff’s試劑脂肪

四氧化鋨+不飽和脂肪酸=黑色蘇丹Ⅲ（深紅色）蛋白質(zhì)

Millon反應(yīng)紅色酶如堿