因工程制藥工藝2

生物制藥工程主講教師：劉凱liukai_1982@163.com山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物系第六章基因工程制藥工藝6.1基因工程制藥微生物表達(dá)系統(tǒng)6.2基因工程大腸桿菌的構(gòu)建6.3基因工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)與控制基因工程技術(shù)—基因重組示意圖DNA片段經(jīng)酶切、連接，形成重組DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞系統(tǒng)中擴(kuò)增目標(biāo)基因表達(dá)，生成新產(chǎn)物，出現(xiàn)新性狀6.2基因工程大腸桿菌的構(gòu)建技術(shù)6.2.1構(gòu)建流程6.2.2目標(biāo)基因的克隆6.2.3表達(dá)載體構(gòu)建6.2.4工程菌構(gòu)建6.2.1工程菌構(gòu)建流程目標(biāo)基因克隆PCR、文庫(kù)，化學(xué)合成表達(dá)載體構(gòu)建酶切、連接遺傳轉(zhuǎn)化與篩選外源基因?qū)肱c培養(yǎng)工程菌新性狀、功能、物質(zhì)工作內(nèi)容方法6.2.2目標(biāo)基因的克隆策略目標(biāo)基因：編碼蛋白質(zhì)或多肽的DNA序列正確克隆的重要性：只要有一個(gè)堿基發(fā)生（錯(cuò)義、無義、移碼）突變，就導(dǎo)致編碼氨基酸的變化，影響產(chǎn)物蛋白質(zhì)的功能和生物學(xué)活性。只要一個(gè)堿基發(fā)生同義突變，就可能導(dǎo)致生產(chǎn)過程和效率變化?；蚩寺》椒ǖ倪x擇方法優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)PCR擴(kuò)增簡(jiǎn)便快速，高效，數(shù)kb，單基因克隆DNA聚合酶活性和保真性限制文庫(kù)篩選長(zhǎng)片段，無堿基錯(cuò)誤，未知序列基因克隆繁瑣，過程復(fù)雜，耗時(shí)，昂貴化學(xué)合成簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確，已知序列，引物合成受合成儀器性能限制，長(zhǎng)度很短PCR技術(shù)PCR（Polymerasechainreaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）：由DNA聚合酶催化下，對(duì)特定DNA序列進(jìn)行的復(fù)制反應(yīng)。本質(zhì)：生物體的DNA復(fù)制原理在體外合成基因。發(fā)明者：Mullis，生物技術(shù)革命性象征，1993年獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。在引物指導(dǎo)下，以DNA為模板，由DNA聚合酶催化的擴(kuò)增特定DNA序列聚合延伸形成互補(bǔ)序列的反應(yīng)。3’AGCGAGGCATCG5’5’TCGCTCCGTAGC3’PCR單反應(yīng)原理與過程(1)變性（94℃）(2)退火（55℃）(4)完成一個(gè)循環(huán)(3)延伸（72℃）PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系組成成分濃度用量作用緩沖液10x5ul提供反應(yīng)環(huán)境dNTPs20mmol/L1ul反應(yīng)的底物正向引物20umol/L2.5ul擴(kuò)增的起始點(diǎn)反向引物20umol/L2.5ul擴(kuò)增的終止點(diǎn)DNA聚合酶1-5U/ul1-2U催化，熱穩(wěn)定性MgCl21.5-5.0mmol/L1ulMg2+是輔酶模板DNA5-10ul含目標(biāo)基因序列H2O27-33ul稀釋總體積50ulPCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳PCR儀水平電泳槽凝膠電泳6.2.2RT-PCR克隆目的基因流程提取RNA轉(zhuǎn)cDNA設(shè)計(jì)合成引物基因片段的3’/5’末端擴(kuò)增RT-PCR擴(kuò)增全長(zhǎng)基因基因片段擴(kuò)增6.2.2RT-PCR克隆目的基因流程1提取RNA從表達(dá)基因的組織中提取總RNA，或mRNA可以用RNA提取kit,Unizol,Trizol大量提取時(shí)可以用傳統(tǒng)的一步法提取--Unizol或Trizol是總RNA提取試劑，在配制過程中加入了異硫氫酸胍，能夠在組織勻漿過程中迅速滅活RNA酶，保持RNA的完整性?？俁NA提取操作步驟：1、細(xì)胞或組織加Trizol后，室溫放置5min，使其充分裂解。注：此時(shí)可放入-70℃長(zhǎng)期保持。2、12,000rpm離心5min，棄沉淀。3、按200

l氯仿/mlTrizol加入氯仿，振蕩混勻后室溫放置15min。注：禁用漩渦振蕩器，以免基因組DNA斷裂。4、4℃12,000g離心15min。5、吸取上層水相，至另一離心管中。注：千萬不要吸取中間界面；若同時(shí)提取DNA和蛋白質(zhì)，則保留下層酚相存于4℃冰箱，若只提RNA，則棄下層酚相。6、按0.5ml異丙醇/mlTrizol加入異丙醇混勻，室溫放置5~10min。7、4℃12,000g離心10min，棄上清，RNA沉于管底。8、按1ml75%乙醇/mlTrizol加入75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀。9、4℃8,000g離心5min，盡量棄上清。10、室溫晾干或真空干燥5~10min。注：RNA樣品不要過于干燥，否則很難溶解。11、可用50

lH2O，TEbuffer溶解RNA樣品，55~60℃,5~10min。注：H2O、TE須用DEPC處理并高壓。RNA提取注意事項(xiàng)嚴(yán)格防止RNA酶污染1.佩戴一次性手套2.玻璃器皿可以在250℃烘箱中烘烤3小時(shí)3.槍頭、Eppendorf管用0.1%DEPC（攪拌攪勻）水中浸泡。通風(fēng)櫥中室溫過夜，扣去液體，高壓滅菌30分鐘。DEPC(diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)為劇毒物，活性很強(qiáng)，小心在通風(fēng)柜中使用。4.DEPC處理的水：0.1%DEPC處理，高壓滅菌30分鐘脫毒5.防止環(huán)境中RNA酶污染2.轉(zhuǎn)cDNA（防RNA酶）逆轉(zhuǎn)錄:將mRNA轉(zhuǎn)錄成為cDNA逆轉(zhuǎn)錄酶：依賴于RNA的DNA聚合酶(反轉(zhuǎn)錄酶)

禽類成髓細(xì)胞病毒(AMV)逆轉(zhuǎn)錄酶

鼠白血病病毒(MLV)反轉(zhuǎn)錄酶,降解RNADNA雜交體中的RNA的能力較弱,對(duì)熱的穩(wěn)定性較AMV反轉(zhuǎn)錄酶差cDNA合成:1.總RNA2.底物，dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP3.引物,起始DNA的合成,oligo(dT)4.逆轉(zhuǎn)錄酶5.DEPC處理水溫浴，按試劑盒說明書。3.引物設(shè)計(jì)特異性引物設(shè)計(jì)Specificprimer簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)Degeneratedprimer嵌套引物Nested

Primer1）長(zhǎng)度15~30bp2）AT:GC約50%，兩引物Tm值接近，55~88℃之間。退火溫度＝Tm(4GC＋2AT)－53）引物3’末端以G/C結(jié)尾較好4）不形成引物二聚體5）特異性,作BLAST搜索6）簡(jiǎn)并引物：保守序列；簡(jiǎn)并度低；具單一密碼子的氨基酸放在3’端7）逆向引物要用互補(bǔ)序列引物設(shè)計(jì)原則1）特異性引物設(shè)計(jì)基因序列已知時(shí),可以設(shè)計(jì)特異性引物特異性引物：有準(zhǔn)確的堿基序列

F：XXXF，5’-

XXXXXXatggccgcttcgcgtgcaacg-3’

atggccgcttcgcgtgcaac

gtttgttgcgctcgtgtgcgctctcgcgctcgccgccgccgatgtgcagaatccgctcagtgacgatttcatcaatctcatcaacacaaagcaaaactct----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------aacgaagtcagggaccagggatcttgtggtagctgctggggttcggtgctgtggaggccatgaccgaccggtactgtacatactccaatggaactcaac

acttccatttctccgctga

tcagcggagaaatggaagtgt-3’R：XXXR，5’-

XXXXXX2）根據(jù)蛋白質(zhì)同源序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物DNAMAN當(dāng)基因序列未知時(shí),利用軟件進(jìn)行同源比對(duì),設(shè)計(jì)間并引物用DNAMAN進(jìn)行同源比對(duì),設(shè)計(jì)引物將蛋白質(zhì)序列保存為seq文件格式比對(duì)、系統(tǒng)樹拷貝、保存4.RT-PCR擴(kuò)增目的基因cDNA模板RNA/mRNAPCR擴(kuò)增目的基因cDNAPrimerFPrimerRPCR循環(huán)94°C2’94°C30’’55°C45’’72°C1’72°C10’

25

lvolume10Xbuffer(含MgCl2)，2.5

l

2.5mMdNTP，2

lTemplatecDNA，1

lForwardPrimer，1

l

ReversePrimer，1

lDistilledWater，17.375

l

Taq酶，0.125

l

356.2.3酶切、連接、轉(zhuǎn)化、篩選1.酶切反應(yīng)概念：在特異位點(diǎn)上催化雙鏈DNA分子的斷裂，產(chǎn)生相應(yīng)的限制性片段。5’突出端3’突出端平末端分析基因的限制性內(nèi)切酶譜，確定插入質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)atgaactgtgtttgccgcctggtcctggtcgtgctgagcctgtggccagatacagctgtcgcccctgggccaccacctggcccccctcgagtttccccagaccctcgggccgagctggacagcaccgtgctcctgacccgctctctcctggcggacacgcggcagctggctgcacagctgagggacaaattcccagctgacggggaccacaacctggattccctgcccaccctggccatgagtgcgggggcactgggagctctacagctcccaggtgtgctgacaaggctgcgagcggacctactgtcctacctgcggcacgtgcagtggctgcgccgggcaggtggctcttccctgaagaccctggagcccgagctgggcaccctgcaggcccgactggaccggctgctgcgccggctgcagctcctgatgtcccgcctggccctgccccagccacccccggacccgccggcgcccccgctggcgcccccctcctcagcctgggggggcatcagggccgcccacgccatcctgggggggctgcacctgacacttgactgggccgtgaggggactgctgctgctgaagactcgg/酶切反應(yīng)操作酶切體系組成：DNA，緩沖液，限制性內(nèi)切酶反應(yīng)條件：適宜溫度（37℃），1小時(shí)以上終止反應(yīng)：加熱，加入EDTA，螯合鎂離子電泳檢查：酶切完全性超螺旋3.連接反應(yīng)概念：在連接酶的催化下，將DNA雙鏈上相鄰的3’羥基和5’磷酸基團(tuán)共價(jià)結(jié)合形成3-5磷酸二酯鍵，使兩條斷開的DNA鏈重新連接起來。連接反應(yīng)操作連接體系：載體片段與基因片段，緩沖液，連接酶連接反應(yīng)：16~26℃，數(shù)小時(shí)，或過夜終止反應(yīng)：在70℃加熱10分鐘4.轉(zhuǎn)化概念：把外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞的過程。大腸桿菌轉(zhuǎn)化—CaCl2法感受態(tài)細(xì)胞融化：置冰上，緩慢加入連接反應(yīng)產(chǎn)物：混勻，置冰上30min熱擊：42℃，90s置冰上，1~2min擴(kuò)增培養(yǎng)：加入LB培養(yǎng)基，37℃，45min涂平板：含有抗生素的LB固體培養(yǎng)基上