借助于細胞大規(guī)模培養(yǎng)的生物制藥工程與科學問題研究

借助于細胞大規(guī)模培養(yǎng)的生物制藥工程與科學問題研究華東理工大學張嗣良2009.4發(fā)酵工程產(chǎn)品生產(chǎn)過程微生物培養(yǎng)生物反應(yīng)器產(chǎn)品代謝（表達）產(chǎn)物生物轉(zhuǎn)化酶（生物催化劑）酶反應(yīng)（生物催化）分離制品質(zhì)量標準包裝倉庫運輸…

原料：碳氫化合物碳水化合物…醫(yī)藥、食品、化工品、酶制劑、能源、環(huán)境保護、…生產(chǎn)菌株生物反應(yīng)器過程細胞株：生物反應(yīng)器過程研究工程化中的關(guān)鍵問題功能基因、功能蛋白、組合化學…

基因工程藥物、藥物新靶點、酶制劑工業(yè)生物技術(shù):食品與營養(yǎng)、健康與環(huán)境、資源與能源等重大問題科學問題？高生產(chǎn)率：明顯的成本優(yōu)勢以生物過程的科學問題作為基礎(chǔ)理論研究以關(guān)鍵技術(shù)和共性技術(shù)開展應(yīng)用基礎(chǔ)研究產(chǎn)品為對象的工藝、工程、裝備一體化應(yīng)用技術(shù)研究頭孢菌素C發(fā)酵過程放大

50升發(fā)酵罐（FUS-50L(A)）：平均4萬u/ml，最高達4.5萬u/ml，用油少

l80m3工業(yè)發(fā)酵罐：平均2.5萬u/ml

，最高達3萬u/ml，用油增加30%?試驗結(jié)果

大罐與小罐比較:RQ值差異

32小時前，大罐與小罐的RQ值接近

32小時大罐RQ值升高

70小時左右，大小罐RQ值下降，但小罐更低。

槳型的計算流體力學仿真

通氣量從0.5vvm提高到1.2vvm時，發(fā)現(xiàn)槳間流型干擾氣含量分層現(xiàn)象嚴重通氣短路現(xiàn)象結(jié)論攪拌系統(tǒng)(560kw/180m3≈3.2kw/m3)

設(shè)計不合理引起工業(yè)生產(chǎn)罐混和不均的嚴重問題出現(xiàn)發(fā)酵100小時高耗氧時的供氧不足出現(xiàn)頂部加油區(qū)到發(fā)酵底部的含油濃度梯度，雖然生產(chǎn)大罐加油量大，但實際耗油量減少引起脂肪酶的誘導(dǎo)不均一性發(fā)酵單位下降，用油成本增加，含油發(fā)酵液提取困難，影響產(chǎn)品質(zhì)量改造后攪拌槳模型初步改造結(jié)果2.5-3.0萬u/ml──→3.5萬u/ml維生素B12好氧工業(yè)發(fā)酵優(yōu)化不同攪拌轉(zhuǎn)速下的耗氧率（OUR）

──氧調(diào)控機制的發(fā)現(xiàn)Yx/sYp/smoYp/s

Yx/smo恒化器(chemostat)與宏觀動力學研究13C微觀代謝流測試批發(fā)酵、動態(tài)生長與生產(chǎn)階段中心代謝與次級代謝研究結(jié)果脫氮假單胞菌(P.denitrificans)具有極高的的氧親和力（Qmax）控制不同的耗氧率，有不同的菌體生長和產(chǎn)物生產(chǎn)率發(fā)現(xiàn)TCA回補途徑的重要作用攪拌轉(zhuǎn)速與通氣、前體補入與溶解CO2控制是關(guān)鍵優(yōu)化的生物反應(yīng)器流場設(shè)計(O2、CO2)和操作──工業(yè)生產(chǎn)放大90μg/ml→190μg/ml阿維菌素發(fā)酵過程優(yōu)化4000u/ml阿維菌素形態(tài)與攪拌計算流體力學100M3發(fā)酵罐搖瓶2000u/ml4500u/ml補料操作優(yōu)化發(fā)酵過程中pH基本沒有變化，OUR、CER也基本沒有變化，但是阿維菌素的合成速率提高，最終5050μg/ml，比對照罐批提高了30%。葡萄糖補入速率過快參照過程pH變化加入葡萄糖由于呼吸強度增加，OUR、CER明顯增強，初級代謝加強，導(dǎo)致EMP、TCA途徑中有機酸的積累，pH快速下降，阿維菌素的效價只有3600μg/ml，低于對照組。碳水化合物運輸和代謝為例差異蛋白質(zhì)分析

S.avermitilis

在TSB（左）和復(fù)合培養(yǎng)基（右）中差異表達蛋白點（碳代謝）。“○”代表復(fù)合培養(yǎng)基上調(diào)蛋白點；“□”代表復(fù)合培養(yǎng)基中下調(diào)蛋白點amyA2編碼的α淀粉酶icdA編碼的異檸檬酸脫氫酶132種蛋白中，按功能進行分類主要參與:碳水化合物運輸和代謝、氨基酸的運輸和代謝、核苷酸的運輸和代謝、能量產(chǎn)生和轉(zhuǎn)換、次級代謝物的合成與調(diào)控以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程。Microarray

視覺圖生物芯片中心SOM分析Avermectins合成速率與基因表達宏觀與微觀代謝研究的相關(guān)性S.avermitilis工業(yè)菌株在復(fù)合培養(yǎng)基：OUR、CER、pH、補糖操作的實驗結(jié)果碳水化合物運輸和代謝的差異蛋白質(zhì)分析30小時耗氧率OUR下降。這也體現(xiàn)了發(fā)酵過程中降低能荷，使代謝流向次級代謝遷移的調(diào)控思路。這時阿維菌素開始形成，這與表現(xiàn)出較高的協(xié)迫蛋白表達是一致的，也說明次級代謝物合成的啟動。與參數(shù)相關(guān)分析一致：轉(zhuǎn)速、補糖控制、pH、OUR、形態(tài)微生物過程研究的進展細胞外可操作因素從細胞內(nèi)到細胞外化學工程與控制工程的學科原理，黑箱系統(tǒng)，局限性很大菌種、發(fā)酵、裝備研究互相割裂細胞內(nèi)生理特性研究生命科學與生物技術(shù)發(fā)展由宏觀到微觀細胞內(nèi)生命科學研究的深入20世紀生物學經(jīng)歷了由宏觀到微觀的發(fā)展，特別是系統(tǒng)生物學不同于以往的生物學——僅關(guān)心個別的基因和蛋白質(zhì)，它要研究的是所有的基因、轉(zhuǎn)錄譜、蛋白質(zhì)、代謝譜、組分間的所有相互關(guān)系，是以對生物的全域性（global）研究為特征的。環(huán)境組學的提出生理特性與外界環(huán)境生物體系對外界環(huán)境條件的適應(yīng)性和自我調(diào)整是菌體生理特性與外界環(huán)境的基本特征，這也就是生物過程放大時要考慮的基本科學問題。外界環(huán)境對細胞生理特性的影響主要表現(xiàn)形式細胞的信號傳導(dǎo)系統(tǒng)對外界環(huán)境條件的響應(yīng)，引起細胞轉(zhuǎn)錄表達系統(tǒng)的變化，進而引起細胞代謝網(wǎng)絡(luò)的變化。外界環(huán)境（如溫度、pH）對菌體胞內(nèi)酶的作用或代謝速率所產(chǎn)生的影響；由于反應(yīng)器混合傳遞所引起的基質(zhì)（如氧、各種碳源、氮源）供應(yīng)不足或過量，由此產(chǎn)生的胞內(nèi)代謝的變化（能量、代謝流、代謝網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)等）；細胞的群體效應(yīng)：菌齡的非一致性；菌間的相互作用信號轉(zhuǎn)導(dǎo)模式

外界信號刺激HPKPRRHPKRRPDNA轉(zhuǎn)錄水平Proteinproducts膜外配體結(jié)合區(qū)ATPADPHis位點Asn這種影響是相互的

這種環(huán)境因素（或者稱“環(huán)境組”，envirome）

與菌體代謝的相互影響環(huán)境組學研究把工業(yè)微生物發(fā)酵反應(yīng)器體系作為相對封閉的生態(tài)系統(tǒng)，作為系統(tǒng)生物學研究的一部分：用系統(tǒng)生物學的方法開展全域性（global）研究微生物與外在環(huán)境相互作用關(guān)系基因組表達的時序及環(huán)境適用性和相互作用蛋白質(zhì)組的時序及環(huán)境適用性和相互作用代謝組的時序及環(huán)境適用性研究與生物過程研究相聯(lián)系：時變、動態(tài)高度分支科學研究與發(fā)酵過程全局優(yōu)化過程優(yōu)化的切入點？因此，在大量的原始數(shù)據(jù)和原始資料中提取出具有明確生物意義的生物信息就成為重要問題。但是由單一生理調(diào)控機制出發(fā)做出的研究只是揭示了生理調(diào)控的局部和某一時段的特點，因此難于對全局優(yōu)化起決定性作用。如何整體性看待遺傳和生理特性，把宏觀研究與微觀研究相結(jié)合就成為很重要的問題。

復(fù)雜系統(tǒng)多尺度觀點的應(yīng)用──工程學方法生物細胞基因尺度細胞尺度反應(yīng)器尺度生物反應(yīng)器信號轉(zhuǎn)導(dǎo)動力學因子代謝流內(nèi)部反饋環(huán)境變量加氮源稀釋率攪拌通氣加碳源加前體加酸加堿加熱……操作變量時間尺度與空間尺度以多尺度參數(shù)相關(guān)的理論方法解決單一生理調(diào)控機制出發(fā)的研究缺乏全局性概念的問題。呈網(wǎng)絡(luò)多輸入多輸出關(guān)系不是簡單的統(tǒng)計熱力學關(guān)系網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)表現(xiàn)在不同尺度的網(wǎng)絡(luò)狀態(tài)的互動關(guān)系───多輸入多輸出關(guān)系

能量流、物質(zhì)流、信息流生命屬性所特有的時空串聯(lián)反應(yīng)關(guān)系微生物代謝流───網(wǎng)絡(luò)研究的的核心問題多尺度參數(shù)相關(guān)分析每個尺度都有不同的學科原理和變化規(guī)律研究它們的量變到質(zhì)變，以及由此形成的對復(fù)雜系統(tǒng)總體的影響導(dǎo)致發(fā)酵過程參數(shù)相關(guān)性響應(yīng)的原理與方法在眾多因素的海量數(shù)據(jù)中找出發(fā)酵過程全局優(yōu)化的敏感生理參數(shù)。

跨尺度觀察與操作工業(yè)過程通常只在反應(yīng)器尺度上進行測量與操作可以從低一尺度層次來預(yù)測另一尺度層次的規(guī)律

DO-發(fā)酵液中溶解氧濃度、OUR-菌體代謝耗氧速率、CER-二氧化碳釋放速率、RQ-呼吸商-代謝途徑、KLa-生物反應(yīng)器中氧傳遞速率、pH酸堿度、菌體濃度、…等40多個參數(shù)

9-25小時之間RQ呈低谷狀必需限制補葡萄糖新型食品添加劑呈味核苷酸二鈉生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)優(yōu)化研究

參數(shù)相關(guān)分析與狀態(tài)方程建立

通過鳥苷發(fā)酵過程的數(shù)據(jù)采集發(fā)現(xiàn)：4040小時OUR下降，耗糖速率增加，氨氮用量增加

鳥苷產(chǎn)率迅速下降──代謝流遷移生物反應(yīng)器：測量觀察值多尺度：細胞代謝流？狀態(tài)方程建立與系統(tǒng)識別

17種氨基酸的時序變化

紙層析分析有機酸的積累

實測結(jié)果：代謝流分析35小時：丙酮酸、丙氨酸積累

代謝途徑遷移的酶學測試

───HMP途經(jīng)→EMP途經(jīng)磷酸果糖激酶

磷酸葡萄糖脫氫酶

丙酮酸激酶

檸檬酸合成酶

丙氨酸脫氫酶

跨尺度分析與工藝改進

確定以代謝流由EMP向HMP途徑回復(fù)遷移為目標進行過程工藝優(yōu)化，并以O(shè)UR的下降作為跨尺度操作的相關(guān)因子發(fā)現(xiàn)調(diào)控因子A加入后短期內(nèi)OUR的下降速度就開始放慢，到48小時開始維持穩(wěn)定直至放罐，并且發(fā)酵后期的糖耗速率也變慢

關(guān)鍵技術(shù)工藝改進后實施效果小試與中試規(guī)模：

17.2克/L→34克/L(60小時)

100M3生產(chǎn)規(guī)模：

16克/L→32克/L(60小時)

生物反應(yīng)器過程放大生物過程放大的困難放大時不可能同時做到幾何相似、流體運動學相似和流體動力學相似，當在小試研究時某一個對生產(chǎn)產(chǎn)生影響的重要因素沒有被觀察到，而這個因素恰恰在放大時成為關(guān)鍵因子時，就會造成整個發(fā)酵過程放大的失敗。此外，傳統(tǒng)發(fā)酵優(yōu)化在考察環(huán)境對菌體發(fā)酵的影響時往往將環(huán)境因素看為均勻的平均值，而且只關(guān)注其對發(fā)酵最終結(jié)果的影響，由此建立的大多是非結(jié)構(gòu)化的細胞發(fā)酵動力學模型。流場特性可歸結(jié)為生物反應(yīng)器內(nèi)流體力學研究所得到的流場特性，在這些流場作用下對菌體生理特性的影響。溫度梯度對代謝的影響濃度梯度對代謝的影響溶氧水平對代謝的影響剪切對菌體活力的影響通過將兩者整合起來研究其相互作用規(guī)律，有可能為生物反應(yīng)器的優(yōu)化與放大開辟一條新的科學思路

流場特性與生理特性研究相結(jié)合的放大原理流場特性CFD模擬生理特性研究多尺度參數(shù)相關(guān)分析環(huán)境特性研究（細胞內(nèi)生命過程）（多相流場復(fù)雜系統(tǒng)）放大原理的實現(xiàn)高噸位發(fā)酵罐放大370m3發(fā)酵罐紅霉素發(fā)酵過程放大計算流體力學（FCD）

模擬結(jié)果比較——氣含率分布整個罐體中氣體能得到較