植物遺傳轉(zhuǎn)化(-70)課件

8PLANTGENETICTRANSFORMATION教學目的與要求

了解植物遺傳轉(zhuǎn)化的受體，以及植物遺傳轉(zhuǎn)化的方法與原理。自1983年第一個轉(zhuǎn)基因植物問世以來只有20多年的時間，但植物基因工程的發(fā)展日新月異，碩果累累。將外源基因人為導入天然植物中，從遺傳物質(zhì)水平上對植物進行有目的改造，由此獲得轉(zhuǎn)基因植物，其性狀將按著有利于人們需要的方向發(fā)生改變。植物基因工程具有得天獨厚的優(yōu)勢是植物細胞的“全能性”理論。這是動物細胞所不能比擬的，其次是植物基因工程不會像動物或人類基因工程那樣遇到較多的社會、倫理、道德等問題。植物基因工程為育種開辟了一條嶄新的途徑。

經(jīng)過十多年來得探索，基因轉(zhuǎn)化的技術日臻成熟，已經(jīng)形成了以農(nóng)桿菌載體轉(zhuǎn)化和基因槍轉(zhuǎn)化技術為主體的兩大植物基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。這兩種轉(zhuǎn)化系統(tǒng)機理清楚、證據(jù)確鑿，成功的例子最多，約占已獲轉(zhuǎn)基因植物的90%以上。8PLANTGENETICTRANSFORMATI18PLANTGENETICTRANSFORMATION學習后的感受：1.植物遺傳轉(zhuǎn)化受體？2.植物遺傳轉(zhuǎn)化方法？3.轉(zhuǎn)基因植株的再生？4.轉(zhuǎn)基因植株的檢測？8PLANTGENETICTRANSFORMATI28植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.1植物基因轉(zhuǎn)化的受體

植物基因工程中，我們把接受外源(目的)基因的生命體系稱為“受體”。盡管接受外源基因的受體包括葉圓片(盤)、胚性愈傷、胚狀體、愈傷組織、懸浮細胞、原生質(zhì)體等不同的形態(tài)，但其基本形態(tài)還是細胞。其中，葉圓片與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)是最簡單的轉(zhuǎn)化方法；愈傷組織的轉(zhuǎn)化效率高、生長速度快，是快速檢測外源基因表達的最好受體；原生質(zhì)體則是單克隆轉(zhuǎn)化的最佳材料。8PLANTGENETICTRANSFORMATION8植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.1植物基因轉(zhuǎn)化的受體38植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.1植物基因轉(zhuǎn)化的受體8.1.1原生質(zhì)體

原生質(zhì)體是無細胞壁的細胞。與懸浮細胞一樣，被轉(zhuǎn)化的受體是單個獨立的細胞，為選擇遺傳均一性的轉(zhuǎn)基因植株提供了可能性。水稻廣親和品種‘02428’的原生質(zhì)體用聚乙二醇(PEG)法導入具有潮霉素B(HPT)抗性基因、卡那霉素抗性基因(KanR)和昆蟲熒光素酶基因(Luc)的質(zhì)粒pTHL27DNA，在含有25μg/ml潮霉素B和100μg/ml卡那霉素的培養(yǎng)基KPR和N6上連續(xù)培養(yǎng)處理4周，可以很好地除去非轉(zhuǎn)化的敏感的原生細胞；然后在無抗菌素選擇壓力的培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)化細胞可再生植株(楊歧生等，1996)。

8PLANTGENETICTRANSFORMATION8植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.1植物基因轉(zhuǎn)化的受體48植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.1植物基因轉(zhuǎn)化的受體8.1.2懸浮細胞以懸浮細胞作受體的轉(zhuǎn)化方法包括農(nóng)桿菌介導法、基因槍法、PEG介導法、電激法和顯微注射法等。小麥幼胚懸浮細胞用JQ-700基因槍法轉(zhuǎn)化，得到了GUS基因瞬間表達的各項最適參數(shù)。他們還建立了‘冀谷11號’谷子幼穗的懸浮培養(yǎng)細胞系及植株再生體系。將胚性懸浮細胞系接種到MS培養(yǎng)基，20d繼代1次，直至出現(xiàn)綠芽點；然后轉(zhuǎn)入無激素的MS0或1/2MS0培養(yǎng)基分化植株。以基因槍轟擊轉(zhuǎn)化懸浮細胞后，放置48h，檢測GUS短暫表達頻率TTF％為20％-40%；在添加200mg/L卡那霉素的MS培養(yǎng)基上，有5％-10％的愈傷組織具有抗性，且能穩(wěn)定傳代(董云洲等，1998)。

8PLANTGENETICTRANSFORMATION8植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.1植物基因轉(zhuǎn)化的受體58植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.1植物基因轉(zhuǎn)化的受體8.1.3胚性愈傷組織愈傷組織的轉(zhuǎn)化方法也適用于胚性愈傷組織。胚性愈傷組織的轉(zhuǎn)化已在玉米、甘蔗、芹菜等植物上獲得成功。芹菜胚性愈傷組織用根癌農(nóng)桿菌C58C1(pBZ6111)感染后，在MS+2,4-D1mg/L十KT0.1mg/L培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)。在篩選到的氯霉素抗性愈傷組織中檢測到胭脂堿合成酶活性，表明外源基因已整合到芹菜細胞基因組中并得到表達?？剐杂鷤M織可在無激素的基本培養(yǎng)基上增殖，但分化出的再生植株畸形(鄭世學等，1996)。

8PLANTGENETICTRANSFORMATION8植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.1植物基因轉(zhuǎn)化的受體68植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.1植物基因轉(zhuǎn)化的受體8.1.4胚狀體胚狀體是由愈傷組織經(jīng)過改造后分化而來的，其轉(zhuǎn)化方法也同愈傷組織。用根癌農(nóng)桿菌LBA4404介導番木瓜環(huán)斑病毒外殼蛋白（PRSV-CP）與核酸酶（Nuclease）嵌合基因，通過振動共培養(yǎng)法轉(zhuǎn)化番木瓜子葉型胚狀體，在選擇培養(yǎng)基上篩選誘導再生轉(zhuǎn)基因植株。NPTII分析和Southernblot分子雜交結(jié)果表明，PRSV-CP-Nuclease嵌合基因已經(jīng)整合到番木瓜核基因組中（周鵬等，1995）。

8PLANTGENETICTRANSFORMATION8植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.1植物基因轉(zhuǎn)化的受體78植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.1植物基因轉(zhuǎn)化的受體8.1.5葉圓片

葉圓片(葉盤)是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的主要受體。采取新鮮植株上無菌的幼嫩葉片，用打孔器或解剖刀切取直徑3-5mm的葉圓片，在液體培養(yǎng)瓶中與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)20-30min，其間輕輕搖動使農(nóng)桿菌從切口侵入葉片。然后將共培養(yǎng)后的葉圓片在濾紙上吸干，轉(zhuǎn)移到非選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d，再轉(zhuǎn)入含卡那霉素或羧芐青霉素等抗生素的選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)，誘導植株再生，這樣可獲得遺傳均一性較高的轉(zhuǎn)基因植株。8PLANTGENETICTRANSFORMATION8植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.1植物基因轉(zhuǎn)化的受體88植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.1植物基因轉(zhuǎn)化的受體8.1.5葉圓片葉盤法常見于雙子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化，馬鈴薯“東農(nóng)303’’的葉盤用含有質(zhì)粒pPZH1和輔助質(zhì)粒pGV2260雙元載體的根癌農(nóng)桿菌菌株C58C1進行轉(zhuǎn)化，在選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)30d后，葉盤切口形成抗性愈傷組織，轉(zhuǎn)化率為4％-38％；經(jīng)NPTII酶活性分析和DNA分子雜交證實獲得了轉(zhuǎn)基因再生植株(王光清等，1994)。8PLANTGENETICTRANSFORMATION8植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.1植物基因轉(zhuǎn)化的受體98植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.1植物基因轉(zhuǎn)化的受體8.1.6其他受體除了葉圓片、愈傷組織、懸浮細胞或原生質(zhì)體等幾種常見的受體之外，還有多種不同類型的組織或器官可作為外源基因的受體，如子葉、胚軸、莖段、根、體細胞胚、花粉等等。如將切成小段形成一定傷口的金魚草下胚軸與根癌農(nóng)桿菌LBA4404(p35SGUSINT)共培養(yǎng)，通過不定芽途徑獲得抗G418的再生植株，經(jīng)DNA/DNA斑點雜交及GUS活性原位組織檢測，初步證實外源基因GUS已整合到金魚草基因組并得到表達(余迪求等，1996)。8PLANTGENETICTRANSFORMATION8植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.1植物基因轉(zhuǎn)化的受體108植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.2植物基因轉(zhuǎn)化的方法

8.2.1農(nóng)桿菌介導法（Agrobacterium-mediatedtransformation）根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefacience)介導法是植物基因轉(zhuǎn)化中使用最普遍的一種方法。其Ti質(zhì)粒(Tumor-inducingplasmid)具有將DNA整合到植物染色體上，并使之與植物內(nèi)源基因同步表達的能力。

8PLANTGENETICTRANSFORMATION8植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.2植物基因轉(zhuǎn)化的方法118植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8PLANTGENETICTRANSFORMATION8植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8PLANTGENE128植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.2植物基因轉(zhuǎn)化的方法

8.2.1農(nóng)桿菌介導法（Agrobacterium-mediatedtransformation）每個Ti質(zhì)粒都有3個功能區(qū)域。一是T-DNA區(qū)，即轉(zhuǎn)化DNA區(qū)，與病癥發(fā)生有關的基因位于這個區(qū)，決定著腫瘤形態(tài)和冠癭堿的合成；二是vir區(qū)，是T-DNA區(qū)以外的與感染腫瘤有關的區(qū)域；三是分解和利用冠癭堿的區(qū)域，分布著冠癭堿分解酶基因。此外，Ti質(zhì)粒還有一些與致癌性無直接關系的功能區(qū)域，如質(zhì)粒轉(zhuǎn)移基因——控制Ti質(zhì)粒在菌株之間的轉(zhuǎn)移，還有農(nóng)桿菌素敏感基因——排斥噬菌體API基因，精氨酸分解代謝基因——決定Ti質(zhì)粒間不親和性基因等。8PLANTGENETICTRANSFORMATION8植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.2植物基因轉(zhuǎn)化的方法138植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立

Vir區(qū)的作用：該區(qū)基因不發(fā)生轉(zhuǎn)移，但它在T-DNA轉(zhuǎn)移的過程中起著十分重要的作用，這個區(qū)的缺矢或突變會使發(fā)根農(nóng)桿菌的菌株喪失對植物的侵染能力。Vir區(qū)7個基因群（A-G）的A一直處于活性表達狀態(tài)而其它的6個基因通常情況下處于抑制狀態(tài)。發(fā)根農(nóng)桿菌感染寄主時，被損傷的植物細胞會合成特殊的小分子酚類化合物乙酰丁香酮等，此時其可以與Vir區(qū)A基因的表達產(chǎn)物結(jié)合，誘導其它的聯(lián)合基因的活化，從而發(fā)生感染過程。

Ori區(qū)的功能：在農(nóng)桿菌中啟動質(zhì)粒DNA的復制。8PLANTGENETICTRANSFORMATION8植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立Vir區(qū)的作用：該區(qū)基148植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.2植物基因轉(zhuǎn)化的方法

8.2.1農(nóng)桿菌介導法（Agrobacterium-mediatedtransformation）8.2.1.1T-DNA的結(jié)構(gòu)和功能

T-DNA能進入植物細胞，整合到核DNA中，在受體細胞中復制、轉(zhuǎn)錄和表達，使植物細胞轉(zhuǎn)化成為腫瘤細胞。轉(zhuǎn)化的冠癭瘤細胞能合成一類叫冠癭堿(Opine)的精氨酸衍生物，這是冠癭細胞所特有的代謝產(chǎn)物。

常見的冠癭堿有兩類：一類是章魚堿(Octopine)，是精氨酸與丙酮酸結(jié)合的化合物；另一類為胭脂堿(Nopaline)，是精氨酸與α-酮戊二酸結(jié)合的化合物。

8PLANTGENETICTRANSFORMATION8植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.2植物基因轉(zhuǎn)化的方法158植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.2植物基因轉(zhuǎn)化的方法

8.2.1農(nóng)桿菌介導法（Agrobacterium-mediatedtransformation）8.2.1.1T-DNA的結(jié)構(gòu)和功能

由于誘發(fā)冠癭瘤的農(nóng)桿菌品系不同，可以產(chǎn)生不同類型的冠癭瘤。一類是由章魚堿型Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌所誘發(fā)的腫瘤，是不定型的無組織狀態(tài)。章魚堿型腫瘤的T-DNA可分為TL和TR兩段：左區(qū)(TL)一般為單拷貝；右區(qū)(TR)拷貝數(shù)較多。當TL區(qū)發(fā)生缺失時，農(nóng)桿菌不能誘發(fā)腫瘤；而當TR區(qū)缺失時，只要還有一個完整的TL區(qū)，就能正常地轉(zhuǎn)化植物細胞。

另一類通常是由胭脂堿型Ti質(zhì)粒農(nóng)桿菌所誘發(fā)的，具有形態(tài)差別的冠癭瘤，能從中長出部分莖狀組織與葉狀結(jié)構(gòu)，稱為畸形瘤(Teratomas)。8PLANTGENETICTRANSFORMATION8植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.2植物基因轉(zhuǎn)化的方法168植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8PLANTGENETICTRANSFORMATION8植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8PLANTGENE178植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.2植物基因轉(zhuǎn)化的方法

8.2.1農(nóng)桿菌介導法（Agrobacterium-mediatedtransformation）8.2.1.1T-DNA的結(jié)構(gòu)和功能

冠癭瘤的形成過程包括遺傳信息從細菌轉(zhuǎn)移到植物細胞并整合與表達，這是一種天然的遺傳工程系統(tǒng)。外源基因的表達需要有位于結(jié)構(gòu)基因兩側(cè)的信號序列的調(diào)控，尤其是受體細胞的轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)要能夠識別外源基因的啟動區(qū)，而Ti質(zhì)粒的胭脂堿合成酶基因(nos)的啟動區(qū)正好具有這一功能。T-DNA基因在高等植物細胞中提供了啟動區(qū)和終止區(qū)的序列，具有典型的真核生物的轉(zhuǎn)錄信息。

8PLANTGENETICTRANSFORMATION8植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.2植物基因轉(zhuǎn)化的方法188植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.2植物基因轉(zhuǎn)化的方法

8.2.1農(nóng)桿菌介導法（Agrobacterium-mediatedtransformation）8.2.1.2Ti質(zhì)粒的構(gòu)建

利用農(nóng)桿菌進行遺傳轉(zhuǎn)化前，必須對Ti質(zhì)粒進行改造。改造的目的有以下幾點：（1）去除T-DNA區(qū)的激素基因。因為激素基因的產(chǎn)物會導致轉(zhuǎn)化細胞激素水平的不平衡而引起細胞的無限分裂，阻礙正常植株的再生。（2）保留T-DNA區(qū)的左右邊界，尤其是左邊界，以保證T-DNA的正常轉(zhuǎn)化。8PLANTGENETICTRANSFORMATION8植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.2植物基因轉(zhuǎn)化的方法198植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.2植物基因轉(zhuǎn)化的方法

8.2.1農(nóng)桿菌介導法（Agrobacterium-mediatedtransformation）8.2.1.2Ti質(zhì)粒的構(gòu)建

（3）在去除的T-DNA區(qū)，增加至少一個可以在植物體內(nèi)表達的選擇基因，以使轉(zhuǎn)化細胞易于被檢測出來。

（4）在T-DNA區(qū)外加一個可以克隆外源目的基因的多聚接口。

（5）在T-DNA區(qū)外加一個抗菌素基因標記質(zhì)粒，該基因只能在細菌中表達，而不能在植物中表達。

8PLANTGENETICTRANSFORMATION8植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.2植物基因轉(zhuǎn)化的方法208植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.2植物基因轉(zhuǎn)化的方法

8.2.1農(nóng)桿菌介導法（Agrobacterium-mediatedtransformation）8.2.1.2Ti質(zhì)粒的構(gòu)建

經(jīng)過以上改造的質(zhì)粒稱為“卸裝質(zhì)?！?。目前應用的卸裝質(zhì)粒主要有兩種系統(tǒng)：一種是共整合載體系統(tǒng)；另一種是雙元載體系統(tǒng)。

8PLANTGENETICTRANSFORMATION8植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.2植物基因轉(zhuǎn)化的方法218植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.2植物基因轉(zhuǎn)化的方法

8.2.1農(nóng)桿菌介導法（Agrobacterium-mediatedtransformation）8.2.1.3外源基因的轉(zhuǎn)化

根癌農(nóng)桿菌與煙草細胞原生質(zhì)體共培養(yǎng)，再生了具有明顯腫瘤特征的幼苗(Marton等，1979)。Horsch(1985)等首創(chuàng)了根癌農(nóng)桿菌與植物葉圓盤共同溫育而實現(xiàn)轉(zhuǎn)化的“葉圓盤共培養(yǎng)法”(Leefdiskcocultivation)，實現(xiàn)了煙草的轉(zhuǎn)化。李寶健等(1990)用此法已將外源基因轉(zhuǎn)移到花椰菜、甘藍、苜蓿、花葉芋、胡蘿卜、番茄、煙草等細胞中并得到表達。另外，我國已在龍葵、大豆、甘藍、菊花、諸葛菜等植物上通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化獲得了轉(zhuǎn)化植株。

8PLANTGENETICTRANSFORMATION8植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.2植物基因轉(zhuǎn)化的方法228植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立

除Ti質(zhì)粒外，發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)的Ri質(zhì)粒(Root-inducingplasmid)也已成為植物基因工程載體家庭中的新成員。

發(fā)根農(nóng)桿菌感染植物傷口，向目的植物轉(zhuǎn)入Ri質(zhì)粒中的T-DNA，經(jīng)一段時間后被感染的植物會在不定的部位生出發(fā)狀根。發(fā)狀根沒有向地性，可在無激素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)生長，生長迅速并產(chǎn)生許多分枝，其增長速度一個月可增殖數(shù)倍到數(shù)百倍。發(fā)根農(nóng)桿菌對植物的這種作用主要依賴于其菌體中的Ri質(zhì)粒。例如通過發(fā)狀根培養(yǎng)來生產(chǎn)只有在高度的根趨向分化細胞中才能產(chǎn)生的有用次生代謝物質(zhì)等。8PLANTGENETICTRANSFORMATION8植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立除Ti質(zhì)粒外，發(fā)根農(nóng)238植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8PLANTGENETICTRANSFORMATION8植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8PLANTGENE248植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.2植物基因轉(zhuǎn)化的方法

8.2.1農(nóng)桿菌介導法（Agrobacterium-mediatedtransformation）8.2.1.3外源基因的轉(zhuǎn)化

一般而言，農(nóng)桿菌只感染雙子葉植物；但利用Ti質(zhì)粒作載體已將外源基因?qū)肆怂?、玉米、吊蘭、石刁柏、香蕉等某些單子葉植物中。農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化技術簡單，易于掌握，對植物受體要求不嚴，絕大多數(shù)雙子葉植物和少數(shù)單子葉植物的組織或器官均可，且轉(zhuǎn)化頻率較高，轉(zhuǎn)化周期較短，是目前應用最廣的一種植物遺傳轉(zhuǎn)化方法。

8PLANTGENETICTRANSFORMATION8植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.2植物基因轉(zhuǎn)化的方法258植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.2植物基因轉(zhuǎn)化的方法

8.2.1農(nóng)桿菌介導法（Agrobacterium-mediatedtransformation）8.2.1.3外源基因的轉(zhuǎn)化

對絲石竹幼莖中段、莖段切口、葉片和愈傷組織，用注射器針刺接種109個/mL發(fā)根農(nóng)桿菌菌液。在含500μg/L羧芐青霉素的MS基本培養(yǎng)基上25℃暗培養(yǎng)誘發(fā)毛狀根。將從接種位點長出的毛狀根剪成1-1.5cm小段，毛狀根小段脫分化形成愈傷組織，在不含激素、蔗糖濃度2％的培養(yǎng)基上可獲得再生植株。冠癭堿檢測結(jié)果表明毛狀根、愈傷組織和再生植株都含有由發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒T-DNA編碼合成的農(nóng)桿堿和甘露堿。由此證明Ri質(zhì)粒T-DNA被插入寄主細胞的核基因組中，當植株再生時被穩(wěn)定地傳遞給子代(王敬文等，1992)。

8PLANTGENETICTRANSFORMATION8植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.2植物基因轉(zhuǎn)化的方法268植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8PLANTGENETICTRANSFORMATION例如：農(nóng)桿菌葉盤法轉(zhuǎn)化（主要操作）一、無菌受體材料的準備二、配制培養(yǎng)基

預培養(yǎng)培養(yǎng)基、共培養(yǎng)培養(yǎng)基、篩選培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基三、受體材料預培養(yǎng)四、農(nóng)桿菌培養(yǎng)五、侵染六、共培養(yǎng)七、選擇培養(yǎng)八、繼代選擇培養(yǎng)九、生根培養(yǎng)8植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8PLANTGENE278植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.2植物基因轉(zhuǎn)化的方法

8.2.1農(nóng)桿菌介導法（Agrobacterium-mediatedtransformation）草類遺傳轉(zhuǎn)化過程8PLANTGENETICTRANSFORMATION8植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.2植物基因轉(zhuǎn)化的方法288植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立A.草地早熟禾的愈傷組織的間接誘導；B.胚性愈傷組織的誘導；C.愈傷組織的分化；D.組培苗的再生；E.抗性愈傷組織的篩選；F.轉(zhuǎn)基因苗的壯苗和生根培養(yǎng)；G.轉(zhuǎn)基因植株的再生8PLANTGENETICTRANSFORMATION8植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立A.草地早熟禾的愈傷組織的間298植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.2植物基因轉(zhuǎn)化的方法

8.2.2基因槍轉(zhuǎn)化法（Microprojectilebombardment）

基因槍法又稱微彈射擊法，是由Klein(1987)等建立的。他們利用超聲波使外源DNA液均勻地包裹鎢彈(0.2-2.0μm)，利用手槍的動力原理發(fā)射出微彈與DNA的復合體，擊中靶細胞，穿透細胞壁和原生質(zhì)體膜，為進一步整合到基因組提供機會，實現(xiàn)外源基因在完整組織中的表達。根據(jù)基因槍的動力原理，目前至少有6種不同類型的基因槍：火藥基因槍、高壓放電基因槍、壓縮氣體基因槍、粒子流基因槍、微靶點射基因槍和氣槍基因槍。

8PLANTGENETICTRANSFORMATION8植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.2植物基因轉(zhuǎn)化的方法308植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8PLANTGENETICTRANSFORMATION8植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8PLANTGENE318植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立基因槍轉(zhuǎn)化的操作包括以下6個步驟：（1）靶細胞或組織的預處理，主要是調(diào)節(jié)滲透壓；（2）微粒子彈的制備，將外源DNA液包裹到金屬顆粒上；

金粉和鎢粉是基因槍轉(zhuǎn)化中最普遍采用的金屬顆粒。鎢粉比較便宜，但與DNA結(jié)合時間過長會催化性降解DNA并對某些類型細胞有毒害作用。金粉大小比較一致，不會引起DNA降解，對細胞也無毒害。（3）裝備基因槍；（4）轟擊；（5）過渡培養(yǎng)，在不加選擇壓的培養(yǎng)基上培養(yǎng)一兩周，以利于靶細胞的恢復和外源基因的充分表達；（6）篩選培養(yǎng)或直接分化再生植株。8PLANTGENETICTRANSFORMATION8植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立基因槍轉(zhuǎn)化的操作包括以下6個328植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立

基因槍法已成為繼農(nóng)桿菌介導法之后的第二大基因轉(zhuǎn)化方法，尤其在禾本科作物上應用更為廣泛。例如：美國康乃爾大學的Sanford(1990)利用“基因槍”把目的基因射入桃的胚胎愈傷組織、胚軸、子葉、莖尖和葉片，進行直接轉(zhuǎn)化，并檢測到GUS基因在這些組織中的瞬間表達。基因槍曾成功地轉(zhuǎn)化了小麥、玉米、水稻、蘭花等單子葉植物和云杉等裸子植物，也曾將外源DNA導入線粒體和葉綠體中。目前存在的主要問題一是轉(zhuǎn)化效率普遍較低；二是基因槍的造價高，轉(zhuǎn)化成本也較高。8PLANTGENETICTRANSFORMATION8植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立基因槍法已成為繼農(nóng)桿菌338植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.2植物基因轉(zhuǎn)化的方法

8.2.3聚乙二醇-介導法（PEG-mediatedtransformation）

聚乙二醇(PEG)介導法與PEG誘導原生質(zhì)體融合的機理相似，不同的是后者發(fā)生在原生質(zhì)體之間，而前者發(fā)生在原生質(zhì)體與DNA之間。在高濃度的二價鈣離子(Ca2+)和高pH值的條件下，略帶負電的高分子PEG可能促進DNA向原生質(zhì)體膜沉淀，或參與原生質(zhì)體的內(nèi)吞作用下，使外源DNA分子進入原生質(zhì)體和細胞核，并整合到染色體上。8PLANTGENETICTRANSFORMATION8植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.2植物基因轉(zhuǎn)化的方法348植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.2植物基因轉(zhuǎn)化的方法

8.2.3聚乙二醇-介導法（PEG-mediatedtransformation）

Krens(1982)等用這種方法首先實現(xiàn)了煙草的遺傳轉(zhuǎn)化。用PEG介導法轉(zhuǎn)化諸葛菜子葉及下胚軸原生質(zhì)體，系統(tǒng)研究了轉(zhuǎn)化過程及其影響因素。以諸葛菜下胚軸原生質(zhì)體為受體，PEG介導的主要步驟如下(周冀明等，1996)：（1）將下胚軸切成0.5mm小段，在CPW-13mol/L中質(zhì)壁分離1h，于25-28℃往復式搖床(45r/min)上酶解12h。（2）200目尼龍網(wǎng)過濾，500r/min離心5min，收集原生質(zhì)體。同樣條件下CPW-9mol/L洗兩次，沉淀的原生質(zhì)體重新懸浮于2mLCPW-9mol/L中。

8PLANTGENETICTRANSFORMATION8植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.2植物基因轉(zhuǎn)化的方法358植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.2植物基因轉(zhuǎn)化的方法

8.2.3聚乙二醇-介導法（PEG-mediatedtransformation）（3）在10mL離心管中加入8mLCPW-21S溶液，再緩緩加入上述2mL原生質(zhì)體懸浮液，離心5min(600r/min)。（4）小心吸出漂浮于溶液界面間的原生質(zhì)體，重新用CPW-9mol/L離心洗滌一次，可得純化原生質(zhì)體。（5）將純化后的原生質(zhì)體以(2-5)×106/mL的密度懸浮于1mLMaCa-1中10min，加人25μL質(zhì)粒DNA靜置10min，再加入PEG(相對分子質(zhì)量6000)至終濃度13.3％混勻，室溫靜置30min，輕輕混勻后靜置10min。8PLANTGENETICTRANSFORMATION8植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.2植物基因轉(zhuǎn)化的方法368植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.2植物基因轉(zhuǎn)化的方法

8.2.3聚乙二醇-介導法（PEG-mediatedtransformation）（6）用MaCa-2稀釋至10mL，離心收集，并用MaCa-2和原生質(zhì)體培養(yǎng)基各洗一次，最后調(diào)整密度至5×104/mL，28℃暗培養(yǎng)。

（7）培養(yǎng)一定時間后分別向培養(yǎng)基中加入一定量的潮霉素進行篩選。研究結(jié)果表明，最適質(zhì)粒量為25-30g，PEG濃度為15％，pH值8.0。

8PLANTGENETICTRANSFORMATION8植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.2植物基因轉(zhuǎn)化的方法378植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.2植物基因轉(zhuǎn)化的方法

8.2.3聚乙二醇-介導法（PEG-mediatedtransformation）

PEG法是進行基因直接轉(zhuǎn)移的普遍方法，成本低廉，效果穩(wěn)定。PEG法轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體的頻率雖然較低，但結(jié)合PEG融合細胞、高pH值、熱激和原生質(zhì)體同步處理等其他細胞工程技術的綜合處理，可提高轉(zhuǎn)化效率。其中的影響因素較多，如植物品種及其原生質(zhì)體再生系統(tǒng)的效率，外源基因的濃度與構(gòu)象，攜帶DNA，PEG溶液，加人PEG和DNA的順序(先加DNA好)，介質(zhì)中二價陽離子(Ca2+)的種類和濃度，轉(zhuǎn)化細胞的篩選方法等。

8PLANTGENETICTRANSFORMATION8植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.2植物基因轉(zhuǎn)化的方法388植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.2植物基因轉(zhuǎn)化的方法

8.2.4其他轉(zhuǎn)化方法8.2.4.1電激法(Electroporation)電激法是采用高壓直流電脈沖的“電激穿孔”作用打開原生質(zhì)膜，促進細胞膜吸附的DNA進入植物原生質(zhì)體。電激法轉(zhuǎn)化能有效地將外源DNA導入植物細胞，而且不影響原生質(zhì)體再生植株的過程。Fromnn(1985)首次通過電激穿孔法，將外源CAT基因?qū)擞衩?、胡蘿卜、煙草的原生質(zhì)體并表達。Shimanoto(1989)和Rhodes(1988)利用電激法實現(xiàn)了水稻和玉米原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化。Choudhary(1998)用電穿孔法轉(zhuǎn)化矮牽牛原生質(zhì)體的結(jié)果表明，當電壓為1000V/cm時，GUS活性最高。

8PLANTGENETICTRANSFORMATION8植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.2植物基因轉(zhuǎn)化的方法39植物遺傳轉(zhuǎn)化(-70)課件408植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.2.4其他轉(zhuǎn)化方法8.2.4.2顯微注射法(Microinjection)這是利用特制的顯微注射儀直接將外源遺傳物質(zhì)注入植物細胞的轉(zhuǎn)化方法。該方法雖然每次只能注射少量的受體細胞，但其轉(zhuǎn)化的成功率高，而且可以省去選擇性標記的麻煩。最好選用原生質(zhì)體作為受體，并且需要預先固定才能注射?？茖W家最近提出了一種固定、注射和培養(yǎng)植物原生質(zhì)體的完整方法。在蓋玻片上放一小尼龍環(huán)，環(huán)內(nèi)填滿含有瓊脂糖凝固的培養(yǎng)基；在中央滴1μL含有原生質(zhì)體的瓊脂糖微滴，使每個微滴中只含5-15個原生質(zhì)體。然后對原生質(zhì)體做顯微注射操作，每小時可注射約50個原生質(zhì)體。經(jīng)注射過的原生質(zhì)體微滴可以直接培養(yǎng)，并再生植株。顯微注射法應用于花粉或其他胚胎類組織可能有更好的應用價值，這樣可克服用原生質(zhì)體帶來的培養(yǎng)上的困難。8PLANTGENETICTRANSFORMATION8植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.2.4其他轉(zhuǎn)化方法418植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.2.4其他轉(zhuǎn)化方法8.2.4.2顯微注射法(Microinjection)用顯微注射法將外源基因?qū)牒?2個細胞的油菜小孢子原胚，80％的注射胚再生植株，轉(zhuǎn)基因植株的頻率高達51％，盡管難于注射每個細胞，但通過形成次生胚，嵌合現(xiàn)象得到解決(Neuhaus等，1987)。我國學者建立了用微量注射法將外源DNA導入胚組織的技術。外源海島棉D(zhuǎn)NA導入陸地棉和中棉，獲得了變異的后代；還將抗病棉基因?qū)烁弋a(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的感病品種中，獲得了抗病、優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的棉花新品種(黃駿麟等，1985)。8PLANTGENETICTRANSFORMATION8植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.2.4其他轉(zhuǎn)化方法用428植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.2.4其他轉(zhuǎn)化方法8.2.4.3花粉管通道法(Pollen-tubepathway)周光宇等(1983)首創(chuàng)的花粉管通道法，是將外源DNA的片段在自花授粉后的特定時期注入柱頭或花柱，使外源DNA沿花粉管通道進入胚囊，轉(zhuǎn)化受精卵或其前后細胞。這種方法開創(chuàng)了整株活體轉(zhuǎn)化的先例，在改良農(nóng)作物的遺傳特性上有很大的潛力。已經(jīng)實現(xiàn)了外源DNA對水稻、小麥、棉花、油菜等作物的轉(zhuǎn)化。8PLANTGENETICTRANSFORMATION8植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.2.4其他轉(zhuǎn)化方法438植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.2.4其他轉(zhuǎn)化方法8.2.4.3花粉管通道法(Pollen-tubepathway)DeLaPena等(1987)將外源DNA直接注入黑麥的幼花序中，并獲得了轉(zhuǎn)基因植株。謝永祥等(1995)采用花粉管法，以含有GUS和NPTII基因的pRT99gus質(zhì)粒轉(zhuǎn)化蝴蝶蘭，轉(zhuǎn)基因幼胚及幼苗GUS活性的組織化學分析表明，已獲得部分的轉(zhuǎn)化證據(jù)。PCR和Southern雜交分析表明，授粉后30d左右注射DNA，可得到較高的轉(zhuǎn)化效率。

8PLANTGENETICTRANSFORMATION8植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.2.4其他轉(zhuǎn)化方法448植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.2.4其他轉(zhuǎn)化方法8.2.4.3花粉管通道法(Pollen-tubepathway)

花粉管通道法的特點是直接操作于整體植株，參與了被轉(zhuǎn)化植物的生殖過程，避開了從細胞到組織的培養(yǎng)，并能與常規(guī)育種技術相結(jié)合且操作簡單，經(jīng)濟適用。由于目前對高等植物基因表達調(diào)整的研究較少，沒有完全達到定向改變某一性狀的水平，加之對基因與性狀的聯(lián)系所知有限，因此，這種轉(zhuǎn)化方法不失為一種改變作物遺傳性、培育優(yōu)良品種的可行方法。但是不足之處是，花粉萌發(fā)時柱頭釋放的核酸酶會破壞外源DNA，同時由于花粉管欲進入合子還需要通過重重屏障，因而花粉管通道轉(zhuǎn)化法的轉(zhuǎn)化頻率較低。

8PLANTGENETICTRANSFORMATION8植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.2.4其他轉(zhuǎn)化方法458植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.2.4其他轉(zhuǎn)化方法8.2.4.4脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化(Liposomestransformation)

脂質(zhì)體是磷脂在水中形成的一種由脂雙分子層圍成的囊狀結(jié)構(gòu)，一直被作為生物膜模型從結(jié)構(gòu)和功能上進行研究。由于脂質(zhì)體內(nèi)能夠包裝許多大分子如病毒、核酸和染色體，并能轉(zhuǎn)入植物細胞，所以，開展了以脂質(zhì)體作為植物細胞遺傳工程載體的廣泛研究。

8PLANTGENETICTRANSFORMATION8植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.2.4其他轉(zhuǎn)化方法468植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.2.4其他轉(zhuǎn)化方法8.2.4.4脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化(Liposomestransformation)脂質(zhì)體進入原生質(zhì)體可能有如下的機理：

（1）內(nèi)吞作用：脂質(zhì)體靠近原生質(zhì)體，原生質(zhì)體內(nèi)陷，逐漸將脂質(zhì)體吞入原生質(zhì)體。

（2）融合作用：脂質(zhì)體膜與原生質(zhì)體膜互相交換脂類，在此過程中使內(nèi)含物或脂質(zhì)體進入細胞內(nèi)。此時一般需要加人PEG或二價陽離子。

（3）交換作用：脂質(zhì)體膜與原生質(zhì)體膜互相交換脂類，在此過程中使內(nèi)含物進入細胞。進入細胞的脂質(zhì)體與溶酶體融合，并逐漸被降解，使內(nèi)含物釋放出來。8PLANTGENETICTRANSFORMATION8植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.2.4其他轉(zhuǎn)化方法脂478植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.2.4其他轉(zhuǎn)化方法8.2.4.4脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化(Liposomestransformation)利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化植物原生質(zhì)體的主要步驟如下：

（1）制備植物原生質(zhì)體。

（2）制備脂質(zhì)體：有超聲波法、機械振蕩法、透析法、融合法、注射法和逆向蒸發(fā)法等。超聲波法可制備單層小囊泡脂質(zhì)體，而逆向蒸發(fā)法可產(chǎn)生單層大囊泡脂質(zhì)體。

（3）將脂質(zhì)體與原生質(zhì)體共培養(yǎng)：將0.5mL脂質(zhì)體和1mL植物原生質(zhì)體混合于試管中，加入融合培養(yǎng)基；在37℃下緩慢振蕩30min，然后加入融合劑PEG，混勻后培養(yǎng)15min，用培養(yǎng)液沖稀并洗滌，離心收集原生質(zhì)體。8PLANTGENETICTRANSFORMATION8植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.2.4其他轉(zhuǎn)化方法利488植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.2.4其他轉(zhuǎn)化方法8.2.4.4脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化(Liposomestransformation)

脂質(zhì)體作載體在植物細胞工程中已有廣泛的研究。用脂質(zhì)體包裝帶有抗藥性標志的、編碼氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶嵌合基因的質(zhì)粒DNA，用PEG誘導該脂質(zhì)體與煙草原生質(zhì)體融合，獲得的轉(zhuǎn)基因再生植株具有抗性和轉(zhuǎn)化基因的酶活性，種子能在含有藥物的培養(yǎng)基上正常地萌發(fā)、生長，轉(zhuǎn)化基因能隨種子傳遞到后代，并遵循孟德爾遺傳規(guī)律。脂質(zhì)體作為載體，能保護細胞內(nèi)部的遺傳物質(zhì)；與植物細胞相互作用時毒性很小；受體范圍廣，對原核和真核細胞均適用；制備脂質(zhì)體比其他質(zhì)粒載體容易，價格低廉。8PLANTGENETICTRANSFORMATION8植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.2.4其他轉(zhuǎn)化方法49植物遺傳轉(zhuǎn)化(-70)課件508植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.2.4其他轉(zhuǎn)化方法8.2.4.5激光微束轉(zhuǎn)化法(Lasermicrobeampuncture)

激光微束穿刺技術是利用激光微束在受體植物細胞上穿孔，通過細胞內(nèi)外的滲透壓差將外源基因直接導入帶壁的植物細胞內(nèi)。該法具有很多的優(yōu)點：

（1）操作簡便。受體植物只需經(jīng)過簡單的短時間高滲預處理即可置于加入一定量外源基因的Rose小室中進行激光照射。

（2）受體植物材料廣泛，不受轉(zhuǎn)化方法的限制，且轉(zhuǎn)基因植株篩選過程更為容易。

（3）激光微束儀裝有顯微攝像系統(tǒng)，可以直觀地觀察打孔部位并準確定位于受體細胞的某一部位及細胞器上，對植物傷害小。

（4）轉(zhuǎn)化率高，適應性廣，重復性好。8PLANTGENETICTRANSFORMATION8植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.2.4其他轉(zhuǎn)化方法518植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.2.4其他轉(zhuǎn)化方法8.2.4.5激光微束轉(zhuǎn)化法(Lasermicrobeampuncture)利用激光微束穿刺法已將pBIl21質(zhì)粒DNA導入百脈根。首先，用高滲緩沖液對子葉進行預處理，然后用激光微束穿刺子葉細胞，接著在卡那霉素培養(yǎng)基上篩選具有抗性的綠色小苗。轉(zhuǎn)化植物在卡那霉素濃度為100μg/mL條件下篩選培養(yǎng)3代后，獲得4株轉(zhuǎn)基因植物，DNAPCR擴增分析均為陽性，證實GUS基因已導人百脈根中(周奕華等，1997)。利用此方法也已將菜豆幾丁質(zhì)酶基因?qū)擞筒酥?楊仲毅等，1998)。8PLANTGENETICTRANSFORMATION8植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.2.4其他轉(zhuǎn)化方法利528植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.3轉(zhuǎn)基因植物再生及其檢測

8.3.1轉(zhuǎn)基因植株再生植株再生是基因轉(zhuǎn)移的關鍵步驟，直接決定能否獲得轉(zhuǎn)基因植株。轉(zhuǎn)基因植株的再生一般分為兩種形式：一種是愈傷組織再生，轉(zhuǎn)化后的外植體首先發(fā)生愈傷組織，然后在分化培養(yǎng)基上誘導出芽直至長成一個完整的植株，這是植株再生中最常用的一種方式。下面就以紅豆草為例介紹胚狀體的誘導和再生(劉瑞凝，1993)。

8PLANTGENETICTRANSFORMATION8植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.3轉(zhuǎn)基因植物再生及其檢538植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立（1）取紅豆草無菌苗的下胚軸，在無菌條件下切成3-4cm的小段，置于固體培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基為MS+3％蔗糖+0.8％瓊脂+6-BA2.5mg/L+IAAlmg/L及MS+3％蔗糖+0.8％瓊脂+6-BA2mg/L+IAAlmg/L。（2）外植體于22℃下進行暗培養(yǎng)，三四周后選擇黃色愈傷組織，在MS+3％蔗糖+0.8％瓊脂+2,4-D0.5-2mg/L繼代培養(yǎng)基上進行重復培養(yǎng)，條件同上，每3周轉(zhuǎn)移一次，會發(fā)生黃色顆粒狀愈傷組織，即成型胚狀體。（3）用整體染色與透明技術，在倒置顯微鏡下觀察各個時期胚狀體的發(fā)育情況，可看到從眾多的球形胚、心形胚到子葉的連續(xù)變化過程。（4）將胚狀體轉(zhuǎn)移到無激素的MS培養(yǎng)基上約1.5個月以后，均不同程度地分化出正常苗及畸形苗。8PLANTGENETICTRANSFORMATION8植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立（1）取紅豆草無菌苗的548植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.3轉(zhuǎn)基因植物再生及其檢測

8.3.1轉(zhuǎn)基因植株再生另一種是直接再生，從外植體直接誘導出芽而不經(jīng)過愈傷組織的分化。諸葛菜子葉在MS+BA3mg/L十NAA0.2mg/L培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)，將分化出來的小苗從基部切下，插人生根培養(yǎng)基1/2MS+IBA0.03mg/L中生根，建立了諸葛菜組織培養(yǎng)高頻率再生系，其再生率可達100％。他們采用根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子葉，附加一定量的氨芐青霉素、頭孢霉素和卡那霉素的相應培養(yǎng)基上進行篩選，進而培養(yǎng)出再生苗。轉(zhuǎn)化子葉的芽再生率為51％，獲得完整轉(zhuǎn)基因植株的轉(zhuǎn)化率為5.53％(周冀明等，1996)。

8PLANTGENETICTRANSFORMATION8植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.3轉(zhuǎn)基因植物再生及其檢558植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立轉(zhuǎn)基因植株再生的方式與一般植株再生的方式相同，其中的主要區(qū)別是轉(zhuǎn)基因植株的再生受外源基因、載體系統(tǒng)、抗生素、轉(zhuǎn)化過程的影響。另外，因受體系統(tǒng)不同，轉(zhuǎn)基因植株再生的方式也是不同的(見表)。轉(zhuǎn)基因植株再生一覽表種類及受體轉(zhuǎn)化方法再生方式種類及受體轉(zhuǎn)化方法再生方式絲石竹幼莖、葉片和愈傷組織發(fā)根農(nóng)桿菌愈傷組織辣椒莖尖、下胚軸根癌農(nóng)桿菌愈傷組織芹菜根癌農(nóng)桿菌愈傷組織大豆未成熟葉根癌農(nóng)桿菌胚狀體諸葛菜根癌農(nóng)桿菌直接再生毛白楊離體根根癌農(nóng)桿菌胚狀體8PLANTGENETICTRANSFORMATION8植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立轉(zhuǎn)基因植株再生的方式568植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.3轉(zhuǎn)基因植物再生及其檢測

8.3.2轉(zhuǎn)基因植株的檢測

當帶有目的基因的嵌合基因被轉(zhuǎn)入某種受體系統(tǒng)(細胞或組織)后，必須對轉(zhuǎn)基因植物材料進行分析與鑒定，以確定外源基因是否在轉(zhuǎn)基因植物中正常表達。在建立植物遺傳轉(zhuǎn)化體系時，常采用報告基因作為標記，以便快速檢測。對轉(zhuǎn)基因植株中目的基因的表達主要采用分子生物學方法檢測，包括Southern雜交、Northern雜交、Western雜交和聚合酶鏈式反應(PCR)等方法。8PLANTGENETICTRANSFORMATION8植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.3轉(zhuǎn)基因植物再生及其檢578植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.3轉(zhuǎn)基因植物再生及其檢測

8.3.2轉(zhuǎn)基因植株的檢測8.3.2.1報告基因

報告基因是明顯區(qū)別于受體細胞遺傳背景的選擇標記，又稱選擇標記基因(見表)。具有如下特點：第一，可利用抗菌素抗性報告基因在受體細胞內(nèi)的表達和選擇壓力，從包含大量非轉(zhuǎn)化克隆的受體細胞中選擇出轉(zhuǎn)化細胞系；第二，可以和某些目的基因構(gòu)成嵌合基因，從報告基因的表達了解目的基因的表達情況；第三，可把經(jīng)過不同改造的調(diào)控區(qū)與報告基因相連，觀察報告基因的表達情況測知基因調(diào)控序列，用于研究植物基因的調(diào)控。

8PLANTGENETICTRANSFORMATION8植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.3轉(zhuǎn)基因植物再生及其檢58常見的報告基因基因名稱作用優(yōu)點缺點新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPTⅡ)基因抗氨基環(huán)醇類抗生素選擇標記強受體細胞非特異性磷酸轉(zhuǎn)移酶本底較高，定量分析難氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)基因抗氯霉素，常用于瞬間表達靈敏、精確，10ngCAT酶也可以被檢測，定量分析準確選擇標記較低潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（HPT）基因抗潮霉素可以克服假陽性致癌物質(zhì)，慎用β-葡萄糖酸苷酶(GUS)基因產(chǎn)生熒光物質(zhì)，可用熒光光度計定量測定簡單、方便、靈敏；本底低；低融合蛋白仍有GUS活性

熒光酶素(LUC)基因發(fā)射光子，可通過微光測定儀檢測檢測迅速、靈敏度高，對身體無害，具有報告基因的最佳性質(zhì)

常見的報告基因基因名稱作用優(yōu)點缺點新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(N59

不同的報告基因需要采取不同的檢測方法。如組織化學法是檢測GUS基因最方便的方法。其中最常用的底物是X-Gluc。在GUS活性作用下，X-Gluc水解產(chǎn)生的無色吲哚衍生物發(fā)生氧化二聚作用，形成藍色沉淀。具體操作步驟為：（1）將轉(zhuǎn)化的植物材料中放入適量的固定液，室溫下溫和搖動30-60min；（2）用50mmol/L磷酸緩沖液(pH值7.0)洗10-15min，重復幾次，除去固定液；（3）將植物材料放入X-Gluc染色液中，真空抽濾5min，37℃保溫24h；（4）若需催化氧化，可在染色液中加入終濃度為1mmol/L的鐵氧化鉀或亞鐵氰化鉀溶液；（5）將材料用70％的酒精多次洗滌，除去葉綠素；（6）顯微鏡下觀察。不同的報告基因需要采取不同的檢測方法。如組織化學法是檢608PLANTGENETICTRANSFORMATION8PLANTGENETICTRANSFORMATI618PLANTGENETICTRANSFORMATION

園藝學報，2004，31（6）：737-742”應用綠色熒光蛋白（GFP）報告基因優(yōu)化辣椒的遺傳轉(zhuǎn)化體系”1.對照2.轉(zhuǎn)化位點表達熒光3.表達熒光的愈傷組織4.表達熒光的芽8PLANTGENETICTRANSFORMATI628植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立8.3轉(zhuǎn)基因植物再生及其檢測

8.3.2轉(zhuǎn)基因植株的檢測8.3.2.2Southern雜交法這是Southernl975年發(fā)明的方法，其原理是利用兩條單鏈D