乙型肝炎課件

慢性乙型肝炎

主要內(nèi)容

乙型肝炎病毒

熒光定量PCR技術(shù)HBV-DNA與臨床

什么是乙肝？乙肝：是指由乙型肝炎病毒引起的，以肝臟損害為主的一組全身性傳染病。

臨床表現(xiàn)：以疲乏、食欲減退、厭油、肝功能異常為主，部分病例呈現(xiàn)黃疸。

一、形態(tài)和生物學(xué)特性：

HBV感染者血清中存在三種形式的病毒顆粒：

①大球形顆粒（Dane）：完整的病毒顆粒，含量最少

包膜：HBsAg，糖蛋白，脂質(zhì)

核心：DNA，DNA聚合酶，HBcAg

是病毒復(fù)制的主體。

②小球形顆粒：

僅HBsAg，無核酸，無感染性，含量最多

③管形顆粒：僅HBsAg，無核酸，無感染性

HBV抵抗力很強，在血清中30-32℃可保存6個月，-20℃可保存15年。

電鏡下HBV顆粒HBV病毒結(jié)構(gòu)示意圖HBV基因組結(jié)構(gòu)，1979年二、基因組結(jié)構(gòu)和編碼蛋白根據(jù)HBV全基因序列差異≥8%或S區(qū)基因序列差異≥4%，目前HBV分為A-H八個基因型。各基因型又可分為不同亞型。我國主要是B和C。IFN治療HBV應(yīng)答率：A＞D，B＞C，A、D＞B、C基因型是否影響核苷類似物的療效尚未確定。65℃10h、煮沸10min或高壓蒸氣均可滅活HBV。三、抗原抗體系統(tǒng)HBsAg是HBV感染的主要標(biāo)志，2-12周出現(xiàn)。只有抗原性，無傳染性。目前感染，患者或病毒攜帶者?？?HBs保護性抗體，曾感染或免疫HBeAgHBV復(fù)制及強感染性的指標(biāo)，僅見于HBsAg陽性患者，HBeAg陽性標(biāo)本HBVDNA檢出率90％左右，兩者有著良好的相關(guān)性抗-HBe有一定的保護作用，感染恢復(fù)期，傳染性低，病情趨于穩(wěn)定，預(yù)后良好抗-HBc非保護性抗體，曾感染，病情趨于穩(wěn)定。HBcAb-IgM提示HBV處于復(fù)制狀態(tài)HBcAg主要存在于感染的肝細胞核心，血循環(huán)中游離的極少。與HBVDNA呈正相關(guān)，HBV復(fù)制及強感染性的指標(biāo)。四、分子生物學(xué)標(biāo)記

1.HBV-DNA:主要存在于Dane顆粒中，是病毒復(fù)制和傳染性的直接標(biāo)志。

2.HBV-DNA多聚酶：位于核心部位，血清中HBV-DNA多聚酶活力是判斷病毒復(fù)制、傳染性高低的指標(biāo)之一。

流行病學(xué)1.傳染源：急、慢性乙型肝炎患者，病毒攜帶者；

2.傳播途徑：母嬰傳播、血液及血制品傳播、破損的皮膚和黏膜及性接觸傳播，日常工作或生活接觸一般不會傳染HBV；經(jīng)吸血昆蟲傳播未證實；

3.易感人群：抗HBs陰性者。嬰幼兒是獲得HBV感染的最危險時期。

全球20億曾感染HBV，慢性HBV感染者3.5億我國屬HBV感染高流行區(qū)，一般人群HBsAg陽性率為9.09%，總感染率為57.6%（包括既往感染和現(xiàn)癥感染）。接種與未接種乙型肝炎疫苗人群的HBsAg陽性率分別為4.51%和9.51%。男性高于女性，有家庭聚集現(xiàn)象，嬰幼兒感染多見。自然史10/8/202315急性

HBV感染慢性乙肝肝硬化肝癌失代償期肝硬化

5年病死率70-86%代償期肝硬化

5年病死率14-20%青少年和成人期

5-10%12-25%5年6-15%5年25-30%

嬰幼兒期發(fā)生肝硬化的高危因素包括：病毒載量高、HBeAg持續(xù)陽性、ALT水平高或反復(fù)地波動、嗜酒、合并HCV、HDV或HIV感染等。HBeAg陽性患者的肝硬化發(fā)生率要高于HBeAg陰性者HBV感染是HCC的重要相關(guān)因素。肝硬化患者發(fā)生HCC高危因素包括：男性、年齡、嗜酒、黃曲霉素、合并HCV或HDV感染、持續(xù)肝臟炎癥、持續(xù)HBeAg陽性及HBVDNA持續(xù)高水平等發(fā)病機制免疫清除期非活動或

低復(fù)制期再活動期不治療

但應(yīng)檢測免疫耐受

需治療

不治療

但應(yīng)檢測

需治療

HBV攜帶者

HBsAg(+)HBeAg(+)/

抗-HBe(-)

HBVDNA+++

ALT–

肝活檢-慢乙肝

HBsAg(+)HBeAg(+)/

抗-HBe(-)

HBVDNA++

ALT/AST+++

肝活檢+++HBeAg(-)慢乙肝

HBeAg(-)/

抗-HBe(+)

HBVDNA+

ALT++

肝活檢++非活動狀態(tài)

HBsAg攜帶者

HBeAg(-)/

抗-HBe(+)

HBVDNA-

ALT/AST-

肝活檢-乙肝或HBsAg陽性史超過6個月，現(xiàn)HBsAg和/或HBVDNA仍陽性者，可診斷為慢性HBV感染慢性

乙型肝炎隱匿性

慢性乙肝乙型肝炎

肝硬化

攜帶者

慢性HBV攜帶(耐受)非活動性HBsAg攜帶HBeAg(+)HBeAg(-)慢性

HBV

感染代償期失代償期HBsAg(-)，HBVDNA(+)根據(jù)肝功能損害程度

分為輕度/中度/重度分為活動期/靜止期ALT正常（一）攜帶者大三陽或小三陽，HBVDNA為陽性或陰性，但1年內(nèi)連續(xù)隨訪3次以上

ALT和AST均在正常范圍，肝組織學(xué)檢查無異常（二）慢性乙型肝炎大三陽或小三陽，HBVDNA陽性，血清ALT持續(xù)或反復(fù)升高，或肝組織學(xué)檢查有肝炎病變

(三)隱匿性慢性乙型肝炎

-血清HBsAg陰性，但血清和(或)肝組織中HBVDNA

陽性，并有慢性乙型肝炎的臨床表現(xiàn)?；颊呖砂?/p>

有血清抗-HBs、抗-HBe和(或)抗-HBc陽性-另約20%隱匿性慢性乙型肝炎患者除HBVDNA陽性

外，其余HBV血清學(xué)標(biāo)志均為陰性-診斷需排除其他病毒及非病毒因素引起的肝損傷HBsAg和HBeAg均陽性而HBVDNA陰性？●干擾素或拉米夫定等治療后病毒復(fù)制受抑制?！馪CR所用引物相應(yīng)的DNA序列發(fā)生突變，此引物與突變DNA不能配對結(jié)合?！癫《綝NA整合于宿主肝細胞染色體而血中游離HBVDNA很少或缺乏。為什么要檢測HBV-DNA？

“大三陽”、“小三陽”、“攜帶者”等免疫學(xué)指標(biāo)反應(yīng)的是機體的免疫反應(yīng)狀態(tài)，不能反應(yīng)體內(nèi)病毒復(fù)制水平與感染程度。血清學(xué)指標(biāo)(－)不能排除HBV感染。因此，要準(zhǔn)確知道HBV是否處于復(fù)制狀態(tài)，最準(zhǔn)確的方法還是通過檢測HBVDNA來決定。HBVDNA是HBV本身的遺傳物質(zhì)，是病毒存在和復(fù)制的最可靠、最直接的指標(biāo)，也是患者具有傳染性的標(biāo)志。

怎樣檢測HBV-DNA？熒光定量PCR技術(shù)熒光定量PCR技術(shù)Polymerasechainreaction(PCR)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種DNA的快速擴增技術(shù)。PCR技術(shù)通過兩個短的稱為引物的DNA小片段和一種耐熱酶（TaqDNA聚合酶）的作用，經(jīng)過高溫變性、低溫退火、適溫延伸三個步驟在3個小時內(nèi)反復(fù)循環(huán)30-40次，把特定的DNA片段擴增1000萬倍。每個PCR體系含4種主要成分：含有待擴增序列的DNA模板引物TaqDNA聚合酶脫氧核糖核酸三磷酸（dNTP）

實時熒光定量PCR技術(shù)，是指在反應(yīng)體系中加入熒光標(biāo)記，利用熒光信號積累實時檢測整個PCR過程，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對PCR終產(chǎn)物的分析，最終實現(xiàn)對未知的起始模版進行定量分析的一種技術(shù)，是迄今對已知基因序列的核酸測定中最靈敏的方法。PCR反應(yīng)過程5’5’3’3’d.NTPsTaq酶Primers5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’反應(yīng)組分變性5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’延伸5’3’5’3’5’3’5’3’3’5’3’TaqTaq5’5’重復(fù)退火5’3’5’3’5’3’5’3’5’5’3’3’5’3’5’3’循環(huán)24個拷貝循環(huán)38個拷貝5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’3’5’5’3’5’3’5’3’5’3’TaqMan探針5’5’3’3’d.NTPsTaq酶Primers5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’反應(yīng)體系變性5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’Taql5’3’RQProbe5’3’RQ5’3’5’3’5’3’RQ退火5’3’1.鏈取代Taq3’QR5’5’3’3’QTaqR5’2.水解3.聚合5’3’QTaqR3’5’4.檢測熒光5’3’3’QTaqR5’l每產(chǎn)生一條DNA鏈，就切斷一條探針每切斷一條探針，就產(chǎn)生一個熒光信號信號強度與結(jié)合探針的DNA分子數(shù)成正比原理圖血清標(biāo)本采集一次性無菌注射器抽取受檢者靜脈血3-5毫升，注入紅帽無菌管中室溫（22～25oC）放置30～60分鐘血標(biāo)本使用水平離心機，4000轉(zhuǎn)/分，離心5分鐘吸取上層血清，轉(zhuǎn)移至1.5ml滅菌離心管

嚴禁使用肝素抗凝血標(biāo)本，抑制PCR反應(yīng)結(jié)果分析實驗室檢查常用指標(biāo)？常用指標(biāo)免疫學(xué)檢查病毒學(xué)檢查肝功能檢查指標(biāo)HBsAg抗-HBsHBeAg抗-HBe抗-HBc診斷結(jié)果+++大三陽，急性或慢性現(xiàn)癥感染，傳染性強+++小三陽，有無傳染性應(yīng)結(jié)合HBVDNA檢