用于鎮(zhèn)痛的鎮(zhèn)痛藥篩選模型

用于鎮(zhèn)痛的鎮(zhèn)痛藥篩選模型

疼痛是人類健康中最嚴(yán)重的問題之一。新的鎮(zhèn)痛藥開發(fā)和選擇具有可靠療效、低副作用和無依賴于依賴的新藥物已成為藥物研究的重點(diǎn)。由于疼痛機(jī)制復(fù)雜,所以,研究并利用相應(yīng)的與臨床疼痛癥狀相似的動(dòng)物模型揭示疼痛的機(jī)制、開發(fā)新藥和研究藥物的鎮(zhèn)痛機(jī)制是當(dāng)前的普遍趨勢。本文就近年來國內(nèi)外廣泛應(yīng)用的物理刺激致痛模型、化學(xué)刺激致痛模型、神經(jīng)源性損傷致痛模型等多種動(dòng)物模型的特點(diǎn)及選用原則簡要綜述如下。1物理刺激和疼痛模型1.1熱刺激反應(yīng)模型本方法是利用小鼠和大鼠的爪趾對熱刺激非常敏感,常表現(xiàn)為跳躍、縮足和舔足,而鎮(zhèn)痛藥可延長刺激反應(yīng)時(shí)間的特點(diǎn)來篩選鎮(zhèn)痛藥。本法是一個(gè)經(jīng)典的篩選鎮(zhèn)痛藥的模型,麻醉性鎮(zhèn)痛藥和外周性鎮(zhèn)痛藥可緩解不同溫度熱刺激引起的疼痛,中樞性鎮(zhèn)痛藥可緩解較高溫度(55℃)熱刺激引起的痛反應(yīng),而外周性鎮(zhèn)痛藥可緩解較低溫度(48℃)熱刺激引起的痛反應(yīng),并可研究藥物的時(shí)-效曲線。該模型對組織損傷最小,且簡便易行,應(yīng)用本模型應(yīng)選用雌性鼠,以避免雄性鼠因陰囊受熱松弛與熱板接觸而致反應(yīng)過敏。同時(shí),用此種模型篩選鎮(zhèn)痛藥時(shí)還應(yīng)輔以其它動(dòng)物模型進(jìn)行綜合評價(jià)。1.2小型聚光燈法此方法是為了定量測定人對抗熱輻射的痛閾及評價(jià)阿片類藥物的鎮(zhèn)痛作用而建立,后用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn),通過測量藥物誘導(dǎo)鼠尾部或兔鼻部熱應(yīng)激敏感性的變化來評價(jià)藥物的鎮(zhèn)痛活性。其基本原理是:采用小型聚光燈產(chǎn)生一定強(qiáng)度的光聚集照射于鼠尾距身體1/3處或兔鼻部,小鼠以甩尾潛伏期為痛反應(yīng)指標(biāo),兔以甩頭為痛反應(yīng)指標(biāo)。本法的優(yōu)點(diǎn)為裝置簡單,操作方便,反應(yīng)恒定、靈敏,能準(zhǔn)確測出閾值及刺激強(qiáng)度,是純粹的脊髓反射,適用于篩選麻醉性鎮(zhèn)痛劑與非麻醉性鎮(zhèn)痛劑。但應(yīng)用本法應(yīng)注意,由于甩尾反應(yīng)是純粹的脊髓反射,因此骨骼肌松弛藥也會(huì)出現(xiàn)陽性結(jié)果,所以在解釋結(jié)果時(shí)應(yīng)輔以其它實(shí)驗(yàn)。1.3藥物鎮(zhèn)痛作用的評價(jià)本法也屬于熱刺激致痛模型,其優(yōu)點(diǎn)是通過觀察藥物對不同水溫?zé)岽碳ぶ峦捶磻?yīng)的影響,可初步評價(jià)藥物鎮(zhèn)痛作用的強(qiáng)度。中樞性鎮(zhèn)痛藥和外周性鎮(zhèn)痛藥可緩解不同水溫的熱刺激誘發(fā)的痛反應(yīng),其中中樞性鎮(zhèn)痛藥可緩解較高溫度(55℃)熱刺激引起的痛反應(yīng),而外周性鎮(zhèn)痛藥可緩解較低溫度(45℃)熱刺激引起的痛反應(yīng),可作為臨床前初步評價(jià)受試藥物鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)度的方法之一。2化學(xué)刺激和疼痛的模型2.1體外激素-鎮(zhèn)痛藥模型此模型是用某種化學(xué)刺激性物質(zhì)(如醋酸、酒石酸銻鉀、苯醌、緩激肽、鉀離子等)注入小鼠腹腔后刺激臟層和壁層腹腔,引起較大面積、較長時(shí)間的炎性疼痛,致使小鼠出現(xiàn)扭體反應(yīng),而鎮(zhèn)痛藥可以抑制這種反應(yīng)。該模型適用于中樞和外周鎮(zhèn)痛藥的研究,盡管有些類型的藥物如可樂定和氟哌啶醇對該模型也有作用,但該方法已成為簡單的常規(guī)藥物篩選方法,并且本實(shí)驗(yàn)中的作用強(qiáng)度與臨床鎮(zhèn)痛效果具有明顯的相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)中常采用小鼠腹腔注射0.6%冰乙酸0.2ml/只或0.05%酒石酸銻鉀0.2ml/只致痛,觀察10-20分鐘扭體反應(yīng)的次數(shù)或出現(xiàn)扭體反應(yīng)的動(dòng)物數(shù)。由于該方法缺乏特異性,因此在解釋結(jié)果時(shí)常要參考其它實(shí)驗(yàn)。2.2性特性—致炎劑致痛模型此類模型是利用致炎劑引起炎癥而增加組織對疼痛的敏感性,而鎮(zhèn)痛劑可改變這一敏感性的特性來研究鎮(zhèn)痛藥的療效。此類模型可用于中樞和外周鎮(zhèn)痛藥的研究,如非麻醉性鎮(zhèn)痛藥和非甾體類的抗炎藥等外周鎮(zhèn)痛藥均可增加炎性足爪的痛閾,而阿片類中樞性鎮(zhèn)痛藥不僅增加炎性足爪痛閾,也可增加正常足爪的痛閾,用此類方法還可獲得量效曲線。2.2.1甲醛反應(yīng)時(shí)相此模型是目前國際公認(rèn)的一種較好的研究藥物鎮(zhèn)痛作用的模型,可用于篩選弱的鎮(zhèn)痛藥,其致痛刺激持久,且其疼痛反應(yīng)為2個(gè)時(shí)期,分別代表不同類型的疼痛,第一時(shí)相(0-5分鐘)為甲醛直接刺激神經(jīng)末梢所致,而第二時(shí)相(20-30分鐘)為炎癥介質(zhì)產(chǎn)生并釋放所致。本模型的目的是模擬急性組織損傷所致的持續(xù)性疼痛,一般以大鼠為實(shí)驗(yàn)對象,在動(dòng)物一側(cè)足背皮下注射稀釋的福爾馬林溶液(大鼠50μl/只、小鼠20μl/只),注射后2-4小時(shí)腫脹達(dá)峰值,動(dòng)物行為改變的程度(如舔足時(shí)間)與注射的福爾馬林濃度成正比,且福爾馬林最適宜的濃度范圍是0.5%-2.5%。2.2.2第一次注射成功率高、共感染性染料角叉菜膠與白陶土合并使用可誘發(fā)劇烈的炎癥疼痛。具體方法為:先將動(dòng)物麻醉,向一側(cè)后肢足底注入4%白陶土混懸液0.1ml,并按摩5分鐘,使之在組織中分散,在第一次注射1小時(shí)后再注入2%角叉菜膠溶液0.05ml,并按摩5分鐘,以第一次注射的時(shí)間作為致炎開始的時(shí)間。該模型亦可采用關(guān)節(jié)腔注射。此模型誘發(fā)的炎癥反應(yīng)非常強(qiáng)烈,是一經(jīng)典的全身性抗炎藥篩選模型,在炎性反映的急性相主要表現(xiàn)為中性粒細(xì)胞浸潤和炎性滲出,而在遲發(fā)相以單核、淋巴細(xì)胞浸潤為主。同時(shí),此模型又是一種COX依賴的急性炎癥疼痛模型,以此可研究藥物鎮(zhèn)痛作用與COX的關(guān)系。2.2.3佐劑傷口模型此類型的炎癥性痛模型均以福氏佐劑(主要成分為羊毛脂、石臘油)作為致炎物質(zhì),主要包括以下三種模型:2.2.3.福氏佐劑和二型膠原纖維抑制劑本模型是最早提出的關(guān)節(jié)炎模型之一,采用向大鼠足底皮內(nèi)注射高濃度福氏佐劑的方法,其誘導(dǎo)的是動(dòng)物的免疫反應(yīng)性炎癥,目的是模擬某些自身免疫性疾病如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。此模型適合于進(jìn)行抗類風(fēng)濕的藥物研究和自身免疫性疾病的研究。馬玉琛等人采用Tween80替代無水羊毛脂,再加入二型膠原纖維特異性蛋白制成改良的福氏佐劑用于此疼痛模型,成功誘導(dǎo)出大鼠的關(guān)節(jié)炎模型,且大鼠還出現(xiàn)了體重下降、精神萎靡不振等與人類類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相似的癥狀。但此類型的疼痛模型,其缺點(diǎn)是病變范圍過于廣泛,除了多個(gè)關(guān)節(jié)均有炎癥反應(yīng)外,往往伴隨有機(jī)體多個(gè)器官系統(tǒng)(包括中樞神經(jīng)系統(tǒng))的免疫性病變,因此限制了它在疼痛研究特別是疼痛的中樞神經(jīng)機(jī)制研究中的應(yīng)用。2.2.3.下肢皮內(nèi)損傷為了克服上述模型的缺點(diǎn),常采用此模型,其方法為:把福氏佐劑注射到動(dòng)物后肢足底皮下而非皮內(nèi),造成關(guān)節(jié)周圍局部組織的炎癥反應(yīng)。此模型避免了多發(fā)性關(guān)節(jié)炎病變過廣和建模成功率不高的缺點(diǎn),但本身也存在痛敏持續(xù)時(shí)間較短,機(jī)械痛敏和熱痛敏不易引出等不足,因此目前多用于研究短期關(guān)節(jié)炎疼痛的神經(jīng)機(jī)制。2.2.3.小鼠術(shù)后膝關(guān)節(jié)或踝關(guān)節(jié)腔內(nèi)損傷的大鼠膝關(guān)節(jié)或踝關(guān)節(jié)腔內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)為了解決上述兩種模型存在的問題,本模型將高濃度的福氏佐劑直接注射到大鼠后肢膝關(guān)節(jié)或踝關(guān)節(jié)腔內(nèi),從而誘發(fā)一個(gè)具有急性、慢性兩相的高度局限的關(guān)節(jié)炎癥。此種模型比較易于定量研究,且發(fā)病只局限于關(guān)節(jié)局部,是進(jìn)行長期慢性炎癥痛狀態(tài)下神經(jīng)系統(tǒng)功能改變的理想模型。2.2.5抗痛敏效應(yīng)載體的建立貝爾格萊德大學(xué)的Vuckovic等人2006年用刀豆蛋白A(conA)注射入大鼠后足底制作炎性痛模型,來研究卡馬西平和奧卡西平的抗痛敏效應(yīng)中腎上腺素a2受體的作用,取得了良好的結(jié)果。3神經(jīng)源性疼痛通過外在神經(jīng)源性疼痛感或感此類動(dòng)物模型都是人為的在動(dòng)物的感覺傳導(dǎo)通道上制造損傷造成的,損傷的部位可包括外周神經(jīng)干、脊神經(jīng)、背跟及脊髓,可分為中樞性和外周性兩大類,這些動(dòng)物模型的應(yīng)用價(jià)值取決于它們與人在神經(jīng)源性疼痛時(shí)在痛覺癥狀及感覺變化上的相似程度。3.1痛模型的基礎(chǔ)在人類,腦和脊髓某些部位的損傷可導(dǎo)致中樞性疼痛,文獻(xiàn)中報(bào)道的中樞疼痛模型大部分以脊髓損傷(spinalcordinjury,SCI)為基礎(chǔ),在外傷性或缺血性SCI后,常發(fā)生自發(fā)和誘發(fā)的疼痛。動(dòng)物模型主要包括重物墜落或挫傷型、光化學(xué)所致?lián)p傷型、神經(jīng)毒性物質(zhì)損傷型等。3.1.1身份證件的認(rèn)知模型是最為古老和應(yīng)用最廣泛的脊髓損傷模型,用于模擬脊髓橫斷傷。其方法是使重物落在已手術(shù)暴露脊髓的低胸-腰段平面,造成SCI,導(dǎo)致嚴(yán)重的截癱及相應(yīng)節(jié)段壞死。但此種模型存在一定的缺陷,即SCI的程度難以控制,且這種模型能否造成典型的中樞性疼痛尚無研究報(bào)道。后來的學(xué)者對這一方法做了改進(jìn),改為利用有機(jī)玻璃管引導(dǎo)一定重量的銅錘,在設(shè)定的不同高度墜落至L2節(jié)段脊髓造成SCI,以便能更好的控制SCI的程度,制造出了重復(fù)性好且與人類脊髓損傷的中樞性疼痛最接近的動(dòng)物模型。3.1.2髓管堵塞,并發(fā)癥間損傷此模型采用靜脈注射光敏染料,通過離子激光照射動(dòng)物脊髓的特定區(qū)域,使其脊髓血管的內(nèi)皮細(xì)胞表面產(chǎn)生脈管閉塞和并發(fā)軟組織損傷,導(dǎo)致脊髓缺血。Gaviria等人采用向大鼠靜脈注射玫瑰紅染料后,將動(dòng)物的T9節(jié)段椎體置于波長560nm的激光照射之下,導(dǎo)致血管內(nèi)的光化學(xué)反應(yīng),造成血管阻塞,內(nèi)皮損傷,引起脊髓缺血性損傷。此類型模型主要用于模擬缺血性脊髓損傷導(dǎo)致的中樞性疼痛。3.1.3神經(jīng)物理化學(xué)脊髓損傷后會(huì)發(fā)生很多神經(jīng)化學(xué)遞質(zhì)的變化,而且向動(dòng)物脊髓內(nèi)注射這些神經(jīng)化學(xué)物質(zhì),可以模擬類似人類脊髓損傷后的疼痛,目前研究最多的是使君子酸(quisqualicacid)注射模型。Seo等人也采用鞘內(nèi)注射谷氨酸或P物質(zhì)來制備此類型的疼痛模型。3.2型神經(jīng)損傷模型目前,文獻(xiàn)已報(bào)道了一系列的動(dòng)物模型用于模擬人的外周神經(jīng)病理性痛,其大部分都是作用于坐骨神經(jīng)或脊神經(jīng)或其周圍,差別在于損傷的部位和形式。3.2.1神經(jīng)術(shù)后疼痛是由Wall等于1979年首先介紹的神經(jīng)病理性疼痛模型,具體方法是在麻醉下暴露坐骨神經(jīng),其后用絲線結(jié)扎神經(jīng)干,將結(jié)扎部位切斷,使神經(jīng)殘端產(chǎn)生神經(jīng)瘤。其模擬的疼痛可能類似于臨床上截肢后的殘肢痛、幻肢痛或失覺性痛。因?yàn)榇四Ｐ椭惺軅w殘廢,痛覺反應(yīng)無法引出,所以存在著無法進(jìn)行痛覺異常和痛覺過敏測試的缺陷。3.2.2機(jī)械熱痛閾模型1988年,Bennett和謝益寬研究出此模型,其與臨床神經(jīng)病理性疼痛特征有相似之處,得到疼痛學(xué)界的廣泛應(yīng)用。該模型利用羊腸線環(huán)繞神經(jīng)干做輕度結(jié)扎環(huán)。這是第一個(gè)可以利用檢測機(jī)械和熱痛閾來分析疼痛相關(guān)行為的模型,可用于模擬臨床慢性神經(jīng)壓迫性損傷,如卡壓性神經(jīng)病變和椎間盤突出導(dǎo)致的神經(jīng)根刺激癥狀。但此模型由于是寬松結(jié)扎,結(jié)扎力度難以一致,因而存在損傷程度較難控制的缺陷?，F(xiàn)在,國內(nèi)有人利用不同內(nèi)徑的聚乙烯軟管束縛大鼠單側(cè)坐骨神經(jīng),產(chǎn)生自發(fā)痛、痛覺過敏及誘發(fā)觸痛覺異常等疼痛行為,與坐骨神經(jīng)慢性壓迫模型極為相似,并克服了其在造模中結(jié)扎線的要求較嚴(yán)、力度不好掌握、神經(jīng)束縛程度差異變化比較大、重復(fù)性差的缺點(diǎn)。3.2.3坐骨神經(jīng)損傷Seltzer等報(bào)道了一種與CCI模型相似的神經(jīng)病理痛模型,通過結(jié)扎一側(cè)的坐骨神經(jīng)上段1/2處,可較好地模擬人類局部神經(jīng)損傷所致的燒灼痛。該模型的特點(diǎn)是痛反應(yīng)行為出現(xiàn)早,持續(xù)時(shí)間長,并出現(xiàn)鏡相痛,但也存在著損傷程度難以控制的缺陷。3.2.5坐骨神經(jīng)自由基2000年,Lindenlaub等人建立了坐骨神經(jīng)部分切斷模型,該模型是在坐骨神經(jīng)發(fā)出肌支到股二頭肌之間半橫斷坐骨神經(jīng)。組織學(xué)分析結(jié)果表明,CCI模型發(fā)生了嚴(yán)重的神經(jīng)外膜炎,而PST模型卻沒有,且PST模型在沒有外來介質(zhì)的影響下,復(fù)制出了與CCI模型類似的神經(jīng)痛,這更符合現(xiàn)實(shí)生活中很多病理性痛的情況。3.2.6冷凍治療坐骨神經(jīng)損傷Deleo等人報(bào)道了坐骨神經(jīng)冷凍損傷模型,其用冷凍來代替橫切或結(jié)扎造成坐骨神經(jīng)損傷。此模型所致的神經(jīng)元損傷是可逆性的,可用于研究暫時(shí)性神經(jīng)損傷的影響和康復(fù)過程。3.2.7第3、4脊神經(jīng)之間間斷原位尾干此模型是較新的模型,目前報(bào)道尚不多,其是在第3、4骶神經(jīng)之間切斷低位尾干。本模型最大的特點(diǎn)是可用尾代替后肢進(jìn)行行為學(xué)測試,此外,該模型不會(huì)出現(xiàn)肢體畸形,故易于單盲實(shí)驗(yàn)。3.2.8臨床應(yīng)用模型特點(diǎn)以上幾種模型均屬于外周神經(jīng)干損傷痛模型,但在臨床上更為常見的是慢性腰腿痛。Hu和Song等通過將一根鋼柱植入大鼠一側(cè)腰椎間孔,模擬椎間孔狹窄,建立了背跟節(jié)慢性壓迫模型。此模型與以上幾種模型的區(qū)別在于其保留了外周初級神經(jīng)傳入和傳出功能,其DRG神經(jīng)原胞體受直接持續(xù)壓迫和繼發(fā)炎癥的刺激。以上兩個(gè)特點(diǎn)與臨床跟性痛的情況相似。隨著研究機(jī)制的深入,以及人類所表現(xiàn)出來的越來越多的疼痛癥狀,有研究者模擬臨床上病理性疼痛,又建立了一些新的動(dòng)物模型。如抗腫瘤藥物紫杉醇,廣泛的用于腫瘤化療,但臨床發(fā)現(xiàn)其可導(dǎo)致嚴(yán)重的肌肉痛,為了尋找治療此種疼痛的藥物,Hidaka等人采用向小鼠腹膜內(nèi)注射紫杉醇(10mg/kg)的方法來制造疼痛模型,并研究發(fā)現(xiàn)中草藥Shakuyaku-kanzo-to對這種疼痛有很好的療效。4上存在的差距綜上所述,目前在研究疼痛機(jī)制方面已建立了大量的動(dòng)物模型,但在新方法的建立,原有技術(shù)的完善,以及新理論的形成上還存在差距。如在模型建立的方法上,目前多采用單純外界傷害性刺激的方法,尚不能全面反映疾病內(nèi)在的實(shí)際情況。所以,在今后的研究中應(yīng)加強(qiáng)與臨床研究的合作,弄清楚某一疾病出現(xiàn)疼痛癥狀的根本生理與病理機(jī)制,為疼痛實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立提供更扎實(shí)的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù),進(jìn)而為更快更好地篩選出療效好、副作用低的新型鎮(zhèn)痛藥提供藥理學(xué)基礎(chǔ)。2.2.4福爾馬林致炎性痛模型與術(shù)后臨床Chen等人1999年采用在清醒大鼠后爪的跖面皮下注射蜂毒的方法制備炎性痛模型,且發(fā)現(xiàn)蜂毒致炎性痛模型所表現(xiàn)的持續(xù)的炎性痛反應(yīng)(退縮、提足、舔咬后爪)是單相的,而福爾馬林致炎性痛模型所表現(xiàn)的自發(fā)痛為雙相的,且蜂毒致炎性痛模型引起較少的組織損傷,并在給藥側(cè)后肢表現(xiàn)了顯著的機(jī)械痛覺增敏和熱痛覺增敏,但在對側(cè)后肢則無機(jī)械痛覺增敏現(xiàn)象。提示在研究病理性疼痛潛在的神經(jīng)機(jī)制,尤其是研究自發(fā)痛與痛覺增敏之間關(guān)系方面,蜂毒致痛模型可能優(yōu)于福爾馬林致痛模型。3.2.