臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)

臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)一培養(yǎng)基制備[內(nèi)容]：培養(yǎng)基制備[目的]：1.掌握培養(yǎng)基制備的原理2.熟悉培養(yǎng)基制備的一般方法3.掌握高壓蒸汽滅菌的原理與使用方法4.初步樹立無菌操作的觀念培養(yǎng)基的概念：培養(yǎng)基的種類：1.按物理性狀分類2.按用途分類培養(yǎng)基的制備：原理：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（營(yíng)養(yǎng)瓊脂）是培養(yǎng)細(xì)菌的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，配方中的牛肉膏主要為微生物提供碳源，蛋白胨主要提供氮源，而NaCl提供無機(jī)鹽。在配制固體培養(yǎng)基時(shí)，還要加入瓊脂作為凝固劑。由于培養(yǎng)基用于培養(yǎng)細(xì)菌，故必須進(jìn)行pH的調(diào)整及其無菌和效能的檢驗(yàn)。一、培養(yǎng)基制備材料：營(yíng)養(yǎng)瓊脂、蒸餾水、藥勺、稱量紙、天平、三角燒瓶、量筒、玻璃棒、pH試紙、10%NaOH、比色管、牛皮紙、線繩、紗布、高壓蒸汽滅菌器步驟：1）稱量：用藥勺取營(yíng)養(yǎng)瓊脂，放置在稱量紙上，用天平稱取3.3g。2）溶解：向三角燒瓶?jī)?nèi)加入約70ml的蒸餾水，把上述稱好的營(yíng)養(yǎng)瓊脂倒入其中，加熱攪拌使之全溶，并補(bǔ)充水分至100ml;稍放冷至40-50℃。3）調(diào)整pH值：用精密的pH試紙測(cè)定pH值，并用

10%NaOH調(diào)至所需pH值到7.4-7.6。但一般要比要求的高出0.2，因?yàn)楦邏簻缇螅琾H值常會(huì)降低。4）滅菌：用牛皮紙包裝好上述的燒瓶，并做上標(biāo)記，進(jìn)行高壓滅菌。常用15磅的高壓蒸汽滅菌15-20分鐘。5）分裝：滅菌時(shí)間到后，待高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)壓力下降至零時(shí)，取出燒瓶，待其冷卻至

70℃時(shí)，在無菌操作下將營(yíng)養(yǎng)瓊脂傾注到滅菌平皿內(nèi)，厚度約為0.5-1.0cm。冷卻至40℃

左右即成瓊脂平板培養(yǎng)基。6）無菌檢查：將上述的瓊脂平板做上記號(hào)，然后底朝上放在37℃的孵育箱內(nèi)培養(yǎng)24h，以進(jìn)行無菌檢驗(yàn)。二、高壓蒸汽滅菌原理：水的沸點(diǎn)可隨壓力的增加而提高，當(dāng)高壓蒸汽滅菌鍋中水煮沸時(shí)，因鍋是密封的，蒸汽不外溢，而使鍋內(nèi)壓力增加，水的沸點(diǎn)與溫度也隨之升高。因此，高壓蒸汽滅菌是利用高壓蒸汽產(chǎn)生高溫，以及熱蒸汽的穿透力來達(dá)到滅菌的目的。一般在104.3kPa（15磅)的壓力下，蒸汽溫度達(dá)到121.3℃，維持15-20分鐘，就能殺死包括芽胞在內(nèi)的所有微生物。構(gòu)造：雙層金屬壁的蒸氣鍋和嚴(yán)密的蓋，蓋上有排氣閥、安全閥、壓力表等。操作方法：1.加水于高壓鍋的外膽內(nèi)至規(guī)定的位置。2.將待滅菌的物質(zhì)放入高壓鍋的內(nèi)膽，但不可放得過緊。并把上述內(nèi)膽放到高壓鍋內(nèi)，蓋上鍋蓋，把排球按插入排氣孔，旋緊壓蓋螺絲，使之嚴(yán)密。3.通電加熱，當(dāng)壓力表指針指到5磅時(shí)，打開排氣閥，使鍋內(nèi)冷空氣排盡。當(dāng)壓力表指針下降回零，將排氣閥關(guān)好。4.繼續(xù)加熱，鍋內(nèi)壓力逐漸升高，直至壓力表上指針指到

15磅時(shí)，開始計(jì)時(shí)，維持該壓力在15-20分鐘內(nèi)。5.滅菌時(shí)間到后，停止加熱，待壓力下降到零磅時(shí)，打開排氣閥，使鍋內(nèi)外壓力平衡，再開蓋取物品。6.滅菌鍋用完后，將鍋內(nèi)剩余水排掉，以免日久腐蝕。注意事項(xiàng)：1.外膽的水不宜過多，否則水沸騰時(shí)溢入內(nèi)膽使物品浸濕；但水也不可過少否則蒸氣壓力不夠。2.在使用高壓蒸汽滅菌時(shí)，應(yīng)在加熱后先將容器內(nèi)冷空氣排盡，如果沒有，則壓力雖升高，但溫度并沒真正升高，這樣滅菌就不可靠。3.被滅菌的物品不要放置過多，塞得過緊，以免蒸汽不能流暢，使水蒸氣不能充分與物品接觸，影響滅菌效果。4.滅菌后要慢慢放氣減壓，以免容器中的液體及棉塞因突然迅速減壓沖出。若為紗布、衣服等應(yīng)待放氣完畢隔半小時(shí)后取出，這樣利用器內(nèi)余熱，使之烘干。5.溶液滅菌時(shí)，瓶塞切勿用木塞或橡皮塞，因其內(nèi)外壓力不一，可發(fā)生爆炸或液體溢出現(xiàn)象。6.效能測(cè)定：為了確保滅菌效果，應(yīng)定期檢查滅菌效能。常用的方法是用硫磺粉末（熔點(diǎn)為115℃）或安息香酸（熔點(diǎn)為120℃）將其置于試管內(nèi)，如上述物質(zhì)熔化，即說明高壓蒸汽內(nèi)溫度已達(dá)到要求，滅菌效果是可靠的。實(shí)驗(yàn)二細(xì)菌的接種培養(yǎng)與分布【內(nèi)容】：1.細(xì)菌的分離培養(yǎng)接種2.細(xì)菌的分布（空氣中、人體體表）【目的】：1.掌握細(xì)菌的分離培養(yǎng)接種法2.熟悉細(xì)菌在自然界及人體內(nèi)的分布3.牢固樹立無菌操作的觀念一、細(xì)菌的分離接種培養(yǎng)【原理】：多種細(xì)菌混雜時(shí)，欲分離某一種細(xì)菌，可采用平板畫線分離方法，將混雜的細(xì)菌分離。經(jīng)過培養(yǎng)，單個(gè)細(xì)菌能形成菌落，挑取單個(gè)菌落可獲得純菌種。【材料】：金黃的葡萄球菌和大腸桿菌的混合菌液、普通瓊脂平板、接種環(huán)、酒精燈、【方法】：1.左手持菌管下端，右手持接種環(huán)燒灼滅菌。2.在酒精燈火焰旁，以右手的小魚際肌、小指夾住試管帽，并將試管口通過火焰。3.用已燒灼后冷卻過的接種環(huán)挑取混合菌液，取完后，管口通過火焰，蓋上試管帽，放回試管架。左手持瓊脂平板，在火焰旁打開平皿蓋約

45°，將接種環(huán)上的細(xì)菌在平板上的一側(cè)邊緣涂開。然后以接種環(huán)與平板成30-40°，輕觸平板，通過涂菌處以腕力輕快的滑移接種環(huán)，作1／3區(qū)域畫線，畫線要密但不能重疊。4.取出接種環(huán)燒灼滅菌，蓋上平皿蓋。旋轉(zhuǎn)平皿，待接種環(huán)冷卻，平皿蓋打開約45°角，從第一區(qū)開始畫線，前幾條線可與第一區(qū)相交，后幾條線不要相交，畫線要疏但不重疊，也作1／3區(qū)域畫線。如此再作第三區(qū)的畫線。5.畫線完畢，蓋好平皿，燒灼接種環(huán)滅菌。平皿底作記號(hào)，倒置于37℃溫箱培養(yǎng)24h。二、細(xì)菌的分布【原理目的】：細(xì)菌分布很廣，在自然界的空氣、土壤、水等均有分布，而且在人體的體表及與外界相通的腔道內(nèi)都有分布。通過該實(shí)驗(yàn)的操作，要求同學(xué)牢固樹立無菌操作的觀念。【材料】：普通瓊脂平板、75%酒精、碘酒、棉簽、玻璃筆、生理鹽水、空氣中的微生物分布【方法】：1.一個(gè)實(shí)驗(yàn)班提供兩塊瓊脂平板，分別對(duì)它們做上記號(hào)，然后一塊放在實(shí)驗(yàn)室前面，一塊放在實(shí)驗(yàn)室后面，均打開平皿蓋，暴露空氣中30分鐘。2.時(shí)間到后，蓋上平皿蓋，倒置于37℃的溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h。人體微生物的分布【方法】：1.每人一塊平板，用玻璃筆在平皿底部畫一“十”字號(hào)，同時(shí)分別在四個(gè)區(qū)作“前”、“后”、“鼻”、

“任”標(biāo)記。2.在酒精燈火焰旁，左手打開平皿蓋45°，取右手任一手指，不要做任何處理，在平皿內(nèi)對(duì)應(yīng)的“前”的位置上，作涂布。然后取出手指，蓋上平皿蓋，用棉簽分別蘸取碘酒、75%酒精對(duì)該手指的末端進(jìn)行消毒，待酒精揮發(fā)干后，打開平皿蓋45°，在平皿內(nèi)對(duì)應(yīng)“后”的位置上，作涂布。然后取出手指，蓋上平皿蓋。3.在酒精燈火焰旁，取一棉簽，蘸取生理鹽水，在鼻腔內(nèi)取分泌物，打開平皿蓋45°，在平皿內(nèi)對(duì)應(yīng)“鼻”的位置上，作涂布。然后取出棉簽，蓋上平皿蓋。棉簽丟在規(guī)定的位置。4.在酒精燈火焰旁，取一棉簽，蘸取生理鹽水，在任何部位擦拭后，打開平皿蓋45°，在平皿內(nèi)對(duì)應(yīng)“任”的位置上，作涂布。然后取出棉簽，蓋上平皿蓋。棉簽丟在規(guī)定的位置。5.作完，在平皿底部做記號(hào)，倒置于37℃溫箱培養(yǎng)24h。實(shí)驗(yàn)三細(xì)菌革蘭染色【內(nèi)容】：1.油鏡使用2.細(xì)菌革蘭染色【目的】：1.掌握應(yīng)用油鏡進(jìn)行細(xì)菌形態(tài)的觀察2.掌握細(xì)菌革蘭染色的原理、步驟、意義、目鏡物鏡聚光鏡光學(xué)系統(tǒng)推片器物鏡轉(zhuǎn)換器鏡筒鏡臂玻片固定器調(diào)光手輪粗調(diào)節(jié)螺旋細(xì)調(diào)節(jié)螺旋載物臺(tái)機(jī)械系統(tǒng)底座顯微鏡的使用：重點(diǎn)是油鏡的使用

1.采光：打開電源，轉(zhuǎn)動(dòng)粗螺旋,將載物臺(tái)略下降，再旋轉(zhuǎn)物鏡轉(zhuǎn)換器，將低倍鏡對(duì)準(zhǔn)載物臺(tái)中央的通光孔。打開光圈，上升聚光器，雙眼向目鏡內(nèi)觀察，同時(shí)調(diào)節(jié)光線的亮度，使視野內(nèi)的光線均勻，亮度適中。

2.放片：在需觀察的標(biāo)本片上滴一滴石蠟油,然后放到載物臺(tái)上，并用載物臺(tái)上的彈簧夾固定好，然后把觀察的標(biāo)本部位移到通光孔的正中央。

3.觀察：轉(zhuǎn)動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)換器，為油鏡，眼睛從側(cè)面注視鏡頭，旋轉(zhuǎn)粗螺旋使載物臺(tái)上升，鏡面浸在油滴中，并與玻片接觸,這時(shí)眼睛移到目鏡上，用細(xì)螺旋反方向調(diào)節(jié)至物像清晰。

4.油鏡觀察完畢后取下標(biāo)本片，按老師指定位置放好.并下降載物臺(tái)約10mm，把物鏡轉(zhuǎn)到一邊，立即用擦鏡紙拭去鏡頭上的石蠟油.二、革蘭氏染色革蘭染色的原理：1.細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)學(xué)說：革蘭陽性菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)致密，肽聚糖層厚，脂質(zhì)含量少，乙醇不易滲入；革蘭陰性菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)疏松，肽聚糖層薄，含大量脂質(zhì)，乙醇容易滲入。2.等電點(diǎn)學(xué)說：革蘭陽性菌等電點(diǎn)（pH2～3）比革蘭陰性菌等電點(diǎn)（pH4～5）低，在相同的pH條件下，革蘭陽性菌所帶的負(fù)電荷比革蘭陰性菌多，故與帶正電荷的結(jié)晶紫結(jié)合牢固，不易被95%乙醇脫色。3.化學(xué)學(xué)說：革蘭陽性菌菌體含有大量的核糖核酸鎂鹽，可與碘、結(jié)晶紫牢固結(jié)合成大分子復(fù)合物，使已經(jīng)著色的細(xì)菌不被95%乙醇脫色；革蘭陰性菌菌體含很少，故易被95%乙醇脫色。革蘭氏染色的方法：

1.材料：菌種：大腸桿菌與葡萄球菌分區(qū)劃線平板、染液：結(jié)晶紫染液、盧戈氏碘液、95%酒精、石碳酸復(fù)紅染液、玻片、生理鹽水、酒精燈、接種環(huán)、石蠟油、吸水紙、擦鏡紙、2.步驟：（1）涂片：取一干凈玻片，在玻片中央滴一滴無菌生理鹽水，然后點(diǎn)燃酒精燈，在相對(duì)無菌環(huán)境下，把接種環(huán)在火焰上滅菌后，于上次分離劃線的平板里取少許混合細(xì)菌，與生理鹽水均勻混合，涂成約1cm×1cm大小的薄膜，接種環(huán)滅菌放回試管架。（2）固定：把上述玻片的背面放在酒精燈外焰上方高處烘干；然后手持玻片一端，將玻片背面往返通過酒精燈內(nèi)焰三次；固定完畢后，待冷卻再染色。（3）染色：①初染：在固定好的細(xì)菌涂片上滴加結(jié)晶紫染液2～3滴，以全面覆蓋菌膜為度，染色1分鐘后，將玻片用細(xì)水沖洗（不能對(duì)著標(biāo)本沖，應(yīng)玻片傾斜水從上而下沖）至水流無色為止，甩干。②媒染：滴加盧戈氏碘液數(shù)滴，染色1分鐘后用細(xì)水沖洗，甩干。③脫色：滴加95%酒精一滴，輕輕搖動(dòng)玻片，使均勻脫色20

秒，用細(xì)水沖洗，直至由原來淡紫色到無色，甩干。④復(fù)染：滴加稀釋石碳酸復(fù)紅一滴，復(fù)染20秒，用細(xì)水沖洗到水流無色，甩干，再用吸水紙吸干。油鏡觀察：待玻片干燥后，在涂菌處滴一滴石蠟油，然后放到顯微鏡上應(yīng)用油鏡觀察。結(jié)果：

染成紫色的是革蘭陽性菌（葡萄球菌）染成紅色的是革蘭陰性菌（大腸桿菌）革蘭染色的意義：

1.將細(xì)菌分成兩大類。

2.分析細(xì)菌的致病性。

3.臨床藥物的選擇。注意事項(xiàng)：細(xì)菌涂片、干燥、固定初染：結(jié)晶紫1分鐘甩干媒染：盧戈氏碘液1分鐘甩干脫色：

95%酒精20秒甩干復(fù)染：石炭酸復(fù)紅20秒吸干

油鏡觀察水洗水洗水洗水洗一、消毒滅菌掌握消毒、滅菌、無菌的概念。目的：掌握常用的物理消毒滅菌方法。方法：1.煮沸法：（目的：煮沸原理、細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況）[原理]：水溫100℃維持10分鐘可殺死細(xì)菌的繁殖體，細(xì)菌的芽胞需煮沸1-2小時(shí)才殺滅。常用于消毒食具、刀剪、注射器等。［步驟］：（四個(gè)人一個(gè)小組）1）材料：大腸桿菌菌液、枯草桿菌菌液（含芽胞）、肉湯培養(yǎng)基、接種環(huán)、酒精燈、水浴箱、2）取四根肉湯培養(yǎng)管，分別用A、B、C、D編號(hào)。3）右手持接種環(huán)滅菌冷