分子熒光光譜法實(shí)驗(yàn)報(bào)告

實(shí)驗(yàn)二分子熒光光譜法糞僉姓名班級(jí)培養(yǎng)單位學(xué)號(hào)指導(dǎo)老師日期張瑞芳化院413班上海高等研究院2013E李向軍2013年12月11日第三組一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆諢晒夤舛扔?jì)的基本原理及使用。了解熒光分光光度計(jì)的構(gòu)造和各組成部分的作用。掌握分子熒光光度計(jì)分析物質(zhì)的特征熒光光譜：激發(fā)光譜、發(fā)射光譜的測(cè)定方法。了解影響熒光產(chǎn)生的兒個(gè)主要因素。學(xué)會(huì)運(yùn)用分子熒光光譜法對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析。二、 實(shí)驗(yàn)原理原子外層電子吸收光子后，由基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，再回到較低能級(jí)或者基態(tài)時(shí)，發(fā)射出一定波長(zhǎng)的輻射，稱(chēng)為原子熒光。對(duì)于分子的能級(jí)激發(fā)態(tài)稱(chēng)為分子熒光，平時(shí)所說(shuō)的熒光指分子熒光。具有不飽和基團(tuán)的基態(tài)分子經(jīng)光照射后，價(jià)電子躍遷產(chǎn)生熒光，是當(dāng)電子從第一激發(fā)單重態(tài)Si的最低振動(dòng)能級(jí)回到基態(tài)So各振動(dòng)能級(jí)所產(chǎn)生的光輻射。激發(fā)光譜是指發(fā)光的某一譜線(xiàn)或譜帶的強(qiáng)度隨激發(fā)光波長(zhǎng)(或頻率)變化的曲線(xiàn)。橫坐標(biāo)為激發(fā)光波長(zhǎng)，縱坐標(biāo)為發(fā)光相對(duì)強(qiáng)度。激發(fā)光譜反映不同波長(zhǎng)的光激發(fā)材料產(chǎn)生發(fā)光的效果。即表示發(fā)光的某一譜線(xiàn)或譜帶可以被什么波長(zhǎng)的光激發(fā)、激發(fā)的本領(lǐng)是高還是低；也表示用不同波長(zhǎng)的光激發(fā)材料時(shí)，使材料發(fā)出某一波長(zhǎng)光的效率。熒光為光致發(fā)光，合適的激發(fā)光波長(zhǎng)需根據(jù)激發(fā)光譜確定一一激發(fā)光譜是在固定熒光波長(zhǎng)下，測(cè)量熒光體的熒光強(qiáng)度隨激發(fā)波長(zhǎng)變化的光譜。獲得方法：先把第二單色器的波長(zhǎng)固定，使測(cè)定的從m不變，改變第一單色器波長(zhǎng)，讓不同波長(zhǎng)的光照在熒光物質(zhì)上，測(cè)定它的熒光強(qiáng)度，以I為縱坐標(biāo)，入ex為橫坐標(biāo)所得圖譜即熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜，從曲線(xiàn)上找出入ex,,實(shí)際上選波長(zhǎng)較長(zhǎng)的高波長(zhǎng)峰。發(fā)射光譜是指發(fā)光的能量按波長(zhǎng)或頻率的分布。通常實(shí)驗(yàn)測(cè)量的是發(fā)光的相對(duì)能量。發(fā)射光譜中，橫坐標(biāo)為波長(zhǎng)(或頻率)，縱坐標(biāo)為發(fā)光相對(duì)強(qiáng)度。發(fā)射光譜常分為帶譜和線(xiàn)譜，有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)既有帶譜、乂有線(xiàn)譜的情況。發(fā)射光譜的獲得方法：先把第一單色器的波長(zhǎng)固定，使激發(fā)的入ex不變，改變第二單色器波長(zhǎng)，讓不同波長(zhǎng)的光掃描，測(cè)定它的發(fā)光強(qiáng)度，以I為縱坐標(biāo)，Xem為橫坐標(biāo)得圖譜即熒光物質(zhì)的發(fā)射光譜;從曲線(xiàn)上找出最大的入em。熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)濃度的關(guān)系用強(qiáng)度為Io的入射光，照射到液池內(nèi)的熒光物質(zhì)時(shí)，產(chǎn)生熒光，熒光強(qiáng)度If用儀器測(cè)得，在熒光濃度很稀(A<0.05)時(shí)，熒光物質(zhì)發(fā)射的熒光強(qiáng)度If與濃度有下面的關(guān)系：If=KCo三、 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器試劑：羅丹明B乙醇溶液；1-蔡酚乙醇溶液；3,3^Diethyloxadicarbocyanineiodide：標(biāo)準(zhǔn)溶液，10|ig/ml,20|ig/ml,30|ig/ml,40|?ml和未知濃度；蒸儒水；乙醇。儀器：Fluoromax-4熒光分光光度計(jì)；1cm比色皿；spectrofluorometer分析軟件。熒光分析儀器結(jié)構(gòu)：它主要由光源、單色器、液槽、檢測(cè)器和顯示器組成。光源發(fā)出的紫外-可見(jiàn)或者紅外光經(jīng)過(guò)激發(fā)單色器分光后，照到熒光池中的被檢測(cè)樣品上，樣品收到該激發(fā)光照射后，發(fā)出的熒光經(jīng)發(fā)射單色器分光，由光電倍增管轉(zhuǎn)換成相應(yīng)電信號(hào)，再經(jīng)放大器放大反饋進(jìn)入轉(zhuǎn)換單元，將模擬電信號(hào)轉(zhuǎn)換成相應(yīng)數(shù)字信號(hào)，并通過(guò)顯示器或打印機(jī)顯示和記錄被測(cè)樣品譜圖。熒光分析儀器結(jié)構(gòu)示意圖如圖1：檢測(cè)器——大器及記錄.曲圖1.熒光分析儀器結(jié)構(gòu)示意圖四、實(shí)驗(yàn)步驟樣品制備。配置不同濃度的3,3，-Diethyloxadicatbocyanineiodide溶液，分別為1Opg/ml,20|ig/ml,3和未知濃度。打開(kāi)熒光分光光度計(jì)和電腦，預(yù)熱半個(gè)小時(shí)。打開(kāi)spectiofluoiometer分析軟件，進(jìn)行相關(guān)參數(shù)的設(shè)置。首先檢測(cè)羅丹明B的激發(fā)光譜，此時(shí)固定發(fā)射波長(zhǎng)為560nm,檢測(cè)并保存激發(fā)光譜。然后根據(jù)所檢測(cè)的激發(fā)光譜中的最大峰值541imi來(lái)設(shè)置檢測(cè)羅丹明B的熒光光譜的激發(fā)波長(zhǎng)，檢測(cè)并保存所得的熒光光譜。檢測(cè)1-蔡酚的熒光光譜。方法同步驟3。用己配置好的S^^-Diethyloxadicaibocvanineiodide標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行與2中相同的步驟，找到最大激發(fā)波長(zhǎng)與最大發(fā)射波長(zhǎng)，之后選定單點(diǎn)檢測(cè)模式，并設(shè)置成剛選擇的最大激發(fā)波長(zhǎng)與最大發(fā)射波長(zhǎng)，分別對(duì)10pg/ml,20jig/ml,30jig/ml,40pg/ml進(jìn)行檢測(cè)，記錄數(shù)據(jù)，繪制工作曲線(xiàn)。對(duì)未知濃度3,3^Diethyloxadicarbocyaiiuieiodide進(jìn)行檢測(cè)，記錄數(shù)據(jù)，并根據(jù)工作曲線(xiàn)求出濃度。五、【據(jù)記錄和處理數(shù)據(jù)記錄(1)羅丹明B的測(cè)定Waveien爭(zhēng)門(mén)(nm>(8.成。6岫二sdo)-TLS圖2,羅丹明B的激發(fā)光譜(sdo)LS圖3.羅丹明B的熒光光譜adE<08wsdo)LTLS(sdMS900 400 50C 600 700adE<08wsdo)LTLS(sdMS900 400 50C 600 700Wa^*elength(nm)(2)1-蔡酚的測(cè)定35COOO30C00025C00020C00015C00018085C000-5C000- [i. (I, [ | ,200 300 400 SOO 60。Wavelength(nm)圖4.1-蔡附的激發(fā)光譜uoooooo1S000C0010000COCIOOCCCO60000004080820COC00(3)3,39-Diethyloxadicarbocyaiiineiodide的測(cè)定圖5.1-蔡酚的熒光光譜200 300 400 SCO 6C0 700Wavelength(nm)圖6.33-Diethyloxadicarbocyanineiodide激發(fā)光譜ucocoocucococ?1CCOCCOOcodsLS80808codsLS6CCCOOO4C0CG00200C0005SC 68 620 640 66C 6SC 7COWavelength(nm)圖7.3,3^Diethyloxadicaibocyanineiodide熒光光譜(4)3,3^Diethyloxadicarbocyaiiineiodide單點(diǎn)掃描結(jié)果3,3^Diethyloxadicaibocyanmeiodide濃度(|ig/ml)10203040未知濃度熒光強(qiáng)度(cps)數(shù)據(jù)處理和分析由羅丹明B和1-蔡酚的掃描光譜圖可知，前者激發(fā)波長(zhǎng)為541nm,后者的激發(fā)波長(zhǎng)為296nm,二者不同且相差很大。這說(shuō)明這兩種物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)中的電子排布不同，可以用熒光光譜的方法對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性分析。由3,3，-Diethyloxadicarbocyanineiodide的掃描光譜圖知，其發(fā)射波長(zhǎng)為610iiin,激發(fā)波長(zhǎng)為579imio將3,3^Diethyloxadicarbocyaiiineiodide單點(diǎn)掃描結(jié)果進(jìn)行excel作圖,得以下結(jié)果，如圖7.圖7.3,3，-Diethyloxadicarbocyanineiodide的熒光強(qiáng)度與濃度的關(guān)系曲線(xiàn)由該曲線(xiàn)可得，S^^Diethyloxadicarbocyanineiodide的熒光強(qiáng)度與濃度的函數(shù)關(guān)系為W2428C,將未知濃度的熒光度代入可得未知濃度為22院/'ml。六、思考與討論1.影響熒光分析的幾個(gè)主要因素有哪些？答：影響熒光分析的因素主要有以下幾個(gè)：樣品溫度的影響：降低體系溫度可以提高熒光量子產(chǎn)額。樣品的光化反應(yīng)：光化反應(yīng)使熒光強(qiáng)度降低。雜散光干擾：散射光來(lái)自激發(fā)光溶劑分子的散射(瑞利散射)或被小顆?；驓馀莸纳⑸?。通過(guò)在發(fā)射單色儀前和激發(fā)單色儀后插入相應(yīng)的短波截.11：濾光片來(lái)消除。溶劑的影響：增加溶劑的極性，有利于熒光的產(chǎn)生。溶劑的拉曼散射光：當(dāng)溶劑具有拉曼活性時(shí)，在激發(fā)光長(zhǎng)波邊會(huì)出現(xiàn)類(lèi)似熒光的拉曼散射峰。樣品濃度效應(yīng)：濃度高時(shí)熒光強(qiáng)度下降，需要校正。樣品污染的影響：輕微的污染都會(huì)影響測(cè)量的準(zhǔn)確度。溶解氧的影響：溶解氧對(duì)一定樣品有明顯的熒光消光效應(yīng)(猝滅)。pH值的影響：弱酸或弱堿分子和它們的離子在電子構(gòu)型上不同，是不同的型體，各具有特殊的熒光量子產(chǎn)額和熒光光譜。.激發(fā)光譜與發(fā)射光譜有什么關(guān)系？答：發(fā)射光譜與激發(fā)光譜沒(méi)有直接的關(guān)系，但是發(fā)射光譜一般要比激發(fā)光譜波長(zhǎng)長(zhǎng)。.如何進(jìn)行多組分混合物的熒光分析？答：(1