酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑準(zhǔn)備將試劑盒及血清樣本復(fù)溫。標(biāo)準(zhǔn)品：1ml標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液(standarddiluent)重懸標(biāo)準(zhǔn)品(standard),輕微震蕩10min,避免形成泡沫，此時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)品液的濃度為0pg/ml。B：6ml液的濃度為0pg/ml。B：6ml雙蒸水將6ml2X分析稀釋液A、B稀3.分析稀釋液A、釋至12ml，稀釋后的工作液不能凍存。4.檢測(cè)試劑A、B：點(diǎn)動(dòng)離心檢測(cè)試劑A、B,用分析稀釋液A、B分別以1:100將檢測(cè)試劑A、B稀釋成工作濃度。5.洗液：用雙蒸水將20ml30X洗液稀釋成600ml。注意事項(xiàng)：不要在96孔板里面做梯度稀釋實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前15min制備標(biāo)準(zhǔn)品溶液，不要直接在37°C溶解試劑。小心重懸標(biāo)準(zhǔn)品和檢測(cè)試劑A、B至沉淀完全溶解，避免形成氣泡。重懸后的標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)試劑A、B只能使用一次。如果洗液中有沉淀形成，復(fù)溫至室溫，至沉淀完全溶解。建議使用雙蒸水來(lái)稀釋試劑盒樣本。實(shí)驗(yàn)過(guò)程：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：7個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品孔、1個(gè)空白孔。向96孔板的每個(gè)孔中加入100ul標(biāo)準(zhǔn)品及樣本，貼上封板膠，37°C孵育2h。棄孔中液體，不要洗。每孔中加入100ul檢測(cè)試劑A的工作液，貼上封板膠，37C孵育1h。棄孔中液體，350ul洗液清洗孔三次，每次1~2min。每孔中加入100ul檢測(cè)試劑B的工作液，貼上封板膠，37C孵育30min。按照步驟4重復(fù)洗板5次。每孔中加入底物溶液90ul，貼上封板膠后，37C避光孵育15~25min（不超過(guò)30min），溶液顏色變藍(lán)。每孔中加入50ul終止液，溶液顏色變黃，輕輕拍打板的邊緣確保液體混勻。去除板底的液體，立即在酶標(biāo)儀上450nm檢測(cè)。注意事項(xiàng)：準(zhǔn)備工作：使用合適數(shù)量的孔，其余孔于-20C保存。每一步加樣時(shí)間不要超過(guò)10min，加樣時(shí)輕輕混勻并避免形成泡沫。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中保持孔濕潤(rùn)。

清洗過(guò)程中盡量去除所有的液體，尤其在清洗的最后一步?？刂品磻?yīng)時(shí)間：加入TMB底物后每10min觀察顏色變化，避免反應(yīng)過(guò)度。TMB底物溶液容易污染，請(qǐng)避光保存。結(jié)果計(jì)算：對(duì)數(shù)作圖，橫軸為OD值的對(duì)數(shù)，縱軸為濃度的對(duì)數(shù)作規(guī)程：『ASSATPROCEDURESUMWIAFt￥1Add1DDpLstandardorsampletoeachwell.Incubate2hoursat37°C;Add1DOpLpreparedDetectionReagentA.Incubate1hourai37°C;Aspirateandwash3times;Add100pLpreparedDetectionReagentB.Incubate30minutesat37°CAspiratearidwash5time