動物寄生蟲病常規(guī)實驗室診斷技術(shù)

動物寄生蟲病常規(guī)實驗室診斷技術(shù)李永光;賈龍杰【摘要】動物寄生蟲病危害嚴(yán)重，可導(dǎo)致動物生產(chǎn)性能下降，畜產(chǎn)品廢棄甚至動物死亡嚴(yán)重影響了畜牧養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展和人類健康.大多數(shù)動物寄生蟲病臨床癥狀不明顯僅表現(xiàn)為消瘦、貧血、生長發(fā)育受阻、生產(chǎn)性能降低等慢性消耗性疾病的癥狀，因此僅根據(jù)流行病學(xué)和臨床癥狀較難做出診斷，而現(xiàn)代分子生物學(xué)診斷技術(shù)如PCR等由于實驗條件和技術(shù)水平限制很難在基層獸醫(yī)臨床運用.本文結(jié)合基層獸醫(yī)臨床診斷現(xiàn)狀，對常用的一些常規(guī)實驗室診斷技術(shù)進行了歸納總結(jié).旨在促進基層臨床醫(yī)生全面地認(rèn)識動物寄生蟲病，并進行有效的診斷、預(yù)防和治療.【期刊名稱】《畜牧獸醫(yī)雜志》【年(卷)，期】2017(036)005【總頁數(shù)】3頁(P145-147)【關(guān)鍵詞】動物寄生蟲病;癥狀;實驗室診斷技術(shù);重要意義【作者】李永光;賈龍杰【作者單位】定西市臨洮農(nóng)業(yè)學(xué)校，甘肅定西730500;定西市臨洮農(nóng)業(yè)學(xué)校，甘肅定西730500【正文語種】中文【中圖分類】S855.9動物寄生蟲病多屬于慢性消耗性疾病，臨床癥狀不明顯，不能引起人們的充分重視，導(dǎo)致動物生產(chǎn)性能下降，畜產(chǎn)品廢棄甚至動物死亡，對畜牧業(yè)生產(chǎn)、肉食品加工和外貿(mào)出口造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。只有準(zhǔn)確診斷出動物寄生蟲病，阻斷其傳播和擴散，才能保障動物和人類的健康。獸醫(yī)臨床上，僅僅根據(jù)流行病學(xué)和臨床癥狀很難對動物寄生蟲病確診，需要借助一些實驗室診斷技術(shù)才能準(zhǔn)確診斷出常見動物寄生蟲病，目前臨床上常用的實驗室診斷方法有常規(guī)實驗室診斷方法、免疫血清學(xué)診斷方法和分子生物學(xué)診斷技術(shù)。鑒于基層養(yǎng)殖場和農(nóng)村地區(qū)的實驗室條件相對落后，技術(shù)人員操作水平有限，對于運用分子生物學(xué)診斷技術(shù)診斷動物寄生蟲病很難實現(xiàn)，另一方面，寄生蟲病診斷試劑盒尚處于開發(fā)研究的初步階段，在臨床上應(yīng)用較少，故本文重點論述當(dāng)前基層獸醫(yī)臨床上廣泛使用的動物寄生蟲病的診斷方法。1.1糞便檢查法糞便檢查是動物腸道寄生蟲病生前診斷的最基本、最常用的方法。檢查到糞便中的蟲卵、幼蟲或成蟲，可以確診某種寄生蟲病。常用糞便檢查方法有涂片法、飽和食鹽水漂浮法和沉淀法。糞便要盡量新鮮，干燥糞便易導(dǎo)致蟲卵變形，對牛于馬等大動物，可通過直腸檢查法從直腸掏取，對于羊犬貓等中小動物，一般用食指鉤取少量糞便。若采樣糞便不能及時檢查，可將其加入到50~60°C的福爾馬林(5%~10%)溶液中，以保持蟲卵的固有形態(tài)。1.1.1蟲體和蟲卵簡易檢查法(1)肉目艮觀察：對動物排出的新鮮糞便，先用玻璃棒或者小木棒攪拌，觀察是否含有某種寄生蟲體或者是蟲體節(jié)片，繼而在所檢糞便中加5~7倍體積清水進行充分混勻，沉淀后棄去上層渾濁液，再加入等量清水，反復(fù)清洗，直至上層清液清亮，最后用放大鏡觀察糞渣中是否含有蟲體，臨床主要用于消化道蟲體的檢測，如絳蟲、線蟲等。(2)直接涂片法：在潔凈的載玻片上滴1~2滴清水或50%甘油水溶液，取黃豆粒大小的被檢糞塊與之混合，涂勻并剔除粗糞渣，蓋上蓋玻片，置于顯微鏡下檢查。該法簡便易行，適用于檢查各種蠕蟲的蟲卵、球蟲卵囊等，方法簡便，但檢出率較低，可以多制作幾個涂片以提高檢出率。1.1.2飽和食鹽水漂浮法線蟲卵、絳蟲卵和球蟲卵囊密度小于鹽水密度，在鹽水中向上漂浮，浮聚于鹽水表面，取表膜液制片鏡檢，根據(jù)蟲卵形態(tài)確診。將食鹽加入沸騰的水中，邊加入邊攪拌，直到不再溶解為止（1L水大約加400g食鹽）；取5~10g糞便置于100mL小燒杯中，加入10~20倍的飽和食鹽水，用玻璃棒攪拌溶解；用兩層紗布過濾糞溶液，再用250um（60目）細網(wǎng)銅篩過濾，將濾液倒入5mL試管或青霉素小瓶內(nèi)，用膠頭滴管滴加濾液使液體面稍凸出于試管口或瓶口，加蓋載玻片，靜置30min左右，加蓋玻片鏡檢。1.1.3沉淀法吸蟲卵和棘頭蟲卵密度大于水，可自然沉于水底（使用離心沉淀法可以大大縮短沉淀的時間），收集洗干凈的沉淀物制片鏡檢，根據(jù)蟲卵形態(tài)確診。取糞便5~10g置于燒杯中，加入少量水搗成泥狀，再加入10~0倍水充分?jǐn)嚢枞芙猓挥媒饘倬W(wǎng)篩260~250?m（40~60目）或兩層紗布過濾，濾液靜置15~20min，傾去上層液，保留沉渣；再加水與沉淀物重新攪勻，靜置，如此反復(fù)操作，直至上層液透明為止，最后傾去上清液，用滴管或吸管吸取沉淀物滴于載玻片上，加蓋玻片后鏡檢。1.1.4糞便幼蟲培養(yǎng)法圓線蟲目所屬線蟲的蟲卵在形態(tài)上非常相似，很難區(qū)別，臨床上經(jīng)常將含有蟲卵的糞便加以培養(yǎng)，待其中蟲卵發(fā)育成為幼蟲時，再檢查幼蟲，根據(jù)幼蟲形態(tài)上的差異，加以鑒別。在固定于漏斗架上的漏斗下端接一根10~15cm長的膠皮管，其下端用止水夾固定。取10-20g糞便放在漏斗里的金屬網(wǎng)篩上，沿漏斗邊緣緩緩加入40^左右的溫水，直到把糞便淹沒為止，靜置0.5-3.0h,幼蟲從糞便中游出，沉于底部；小心打開止水夾，使底部的液體流入離心管內(nèi)，離心沉淀1min，吸去離心管內(nèi)的上層液，把底部的沉淀物搖勻，用滴管移至載玻片上，或全部倒入小平皿內(nèi)，用放大鏡或在低倍顯微鏡下檢查有無活動的幼蟲。1.2皮膚刮取物檢查法主要用于動物體表微小寄生蟲的檢測，如疥螨（0.2-0.5mm）、癢螨（0.5mm）左右。在脫毛皮膚和健康皮膚交界處刮取皮屑，這里的螨較多，刮取時先剪毛，取凸刃小刀，在酒精燈上消毒，用手握刀，使刀刃與皮膚表面垂直，刮取皮屑時，應(yīng)刮到皮膚輕微出血，然后將皮屑置于黑色背景的培養(yǎng)皿內(nèi)觀察是否有蟲體，或者將皮屑置于載玻片上，滴加50%甘油溶液一滴，制片鏡檢。為了在較多的病料中檢出較少的蟲體，可采用濃集法提高檢出率。1.3肌肉壓片鏡檢法主要用于旋毛蟲的檢測，在左右膈肌角分別剪取24粒肌肉粒，置于載玻片上，制作肌肉壓片，低倍顯微鏡鏡檢觀察在被檢測的肌肉壓片中是否含有肌旋毛蟲包囊。1.4血液檢查法用于伊氏錐蟲、巴貝斯蟲和泰勒蟲等血液內(nèi)寄生蟲的檢查。一般在病畜高溫時采取耳靜脈血液，做成血液涂片鏡檢，或直接鮮血壓滴鏡檢，或血液離心后將蟲體濃集制片鏡檢，發(fā)現(xiàn)某種寄生蟲即可確診。注意班氏絲蟲和馬來絲蟲的微絲蝴在晚間出現(xiàn)在末梢血里，必需在深夜進行檢查。1.5淋巴結(jié)穿刺檢查法適用于泰勒蟲病、弓形蟲病的生前診斷。常規(guī)消毒局部皮膚和術(shù)者手臂，術(shù)者以左手食指和拇指固定淋巴結(jié)，右手持10mL干燥注射器將針頭直接刺入肩前淋巴結(jié)或股前淋巴結(jié)內(nèi)，深度依淋巴結(jié)大小而定，然后邊拔針邊用力抽吸，利用空針內(nèi)的負壓將淋巴結(jié)內(nèi)的液體和細胞成分吸出，固定注射器內(nèi)栓拔出針頭后將注射器取下，充氣后再將針頭內(nèi)的抽出液噴射到玻璃片上制成均勻涂片，染色鏡檢。1.6腹水檢查法主要用于弓形蟲病的生前診斷。常規(guī)消毒局部皮膚和術(shù)者手臂，穿刺腹腔取腹水，在載玻片上抹片，瑞氏染色后鏡檢觀察是否含有滋養(yǎng)體。1.7尿液檢查法常采用清晨尿液，沉淀后取沉淀檢查，本方法著重于檢查泌尿系統(tǒng)寄生蟲蟲體，由于泌尿系統(tǒng)寄生蟲較少，因而此法較少用，中國南方主要用于檢查豬腎蟲。寄生蟲本身及其分泌物、代謝產(chǎn)物等均可作為抗原刺激動物機體產(chǎn)生相應(yīng)抗體，可以通過已知抗原或抗體，檢測動物血清中相應(yīng)抗體或者抗原的存在性，從而判斷該動物是否患有這種寄生蟲病。免疫血清學(xué)診斷方法是動物寄生蟲病生前診斷的重要方法之一。2.1皮內(nèi)實驗宿主在寄生蟲變應(yīng)原刺激后，體內(nèi)產(chǎn)生親細胞性抗體(IgE和IgG4)，當(dāng)其與相應(yīng)抗原結(jié)合后，肥大細胞和嗜堿性粒細胞脫顆粒，釋放生物活性物質(zhì)，引起注射抗原的局部皮膚出現(xiàn)皮丘及紅疹，以此便可判斷體內(nèi)是否含有某種特異性抗體存在，該法操作簡單，并且可現(xiàn)場觀察結(jié)果，適宜現(xiàn)場應(yīng)用，但假陽性率較高。皮內(nèi)試驗用于多種蠕蟲病，如血吸蟲病、肺吸蟲病、姜片吸蟲病、囊蟲病、棘球蝴病等的輔助診斷，具體操作方法如下：按照1：3000的比例制備新鮮成蟲勻漿，使用無菌注射器和皮試針頭對待檢動物進行皮試注射，注射劑量為0.1mL。注射后15min觀察待檢動物的注射部位是否出現(xiàn)丘疹，如果出現(xiàn)要測量其最大直徑，最大直徑大于或等于1.0cm的為陽性反應(yīng)。2.2環(huán)卵沉淀實驗抗原存在于蟲卵內(nèi)，以蟲卵檢測待測動物的血清內(nèi)的特異性抗體，臨床上常用于日本血吸蟲和旋毛蟲幼蟲的檢測。操作方法：抽取待檢動物的血液樣本進行離心處理獲得血清，用融化的石蠟在干凈的載玻片上劃2道間距約為20mm的直線，待石蠟干燥后在2道線間滴加2滴待檢動物的血清。然后再向血清中加入約100個干燥的蟲卵混勻，覆上蓋玻片并用石蠟密封四周。將玻片置于溫箱中培育48h后在顯微鏡下觀察結(jié)果。根據(jù)蟲卵周圍出現(xiàn)的沉淀物的大小進行陽性判斷。2.3間接血凝試驗應(yīng)用公綿羊紅細胞或乳膠顆粒等作為載體，與蟲體抗原相結(jié)合使之致敏，再與患畜血清或其他體液中的抗體結(jié)合產(chǎn)生凝集現(xiàn)象，根據(jù)其凝集程度而判定陽性結(jié)果。操作方法：先在U型微量血凝板的第一排的第一孔、第二孔、第三孔和第四孔內(nèi)分別滴加0.9%的氯化鈉溶液，再向第一孔加入待檢血清樣本混勻，對第二、三、四孔依次根據(jù)遞減稀釋法進行滴加。在第三孔和第四孔內(nèi)加入稀釋后的致敏紅細胞懸液，旋轉(zhuǎn)震搖混勻后在室溫下靜置1h后觀察記錄結(jié)果。根據(jù)四個孔內(nèi)的陽性反應(yīng)情況判斷是否為某種寄生蟲病患者。該法操作簡便，特異性和敏感性均較理想，適宜動物寄生蟲病的輔助診斷和現(xiàn)場流行病學(xué)調(diào)查。主要用于診斷阿米巴病、弓形蟲病、血吸蟲病、囊蟲病、旋毛蟲病、肺吸蟲病和肝片吸蟲病等。2.4酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)將蟲體抗原包被包被聚苯乙烯板，4°C冰箱內(nèi)過夜培育，沖洗后加入患畜血清，使免疫反應(yīng)在載體上進行，然后加入酶標(biāo)記的第二抗體，作為免疫反應(yīng)的指示劑，通過酶對底物的催化作用而產(chǎn)生有色產(chǎn)物，根據(jù)其光密度以定量測定抗體含量。此法可用于宿主體液、排泄物和分泌物內(nèi)特異性抗體或抗原的檢測，靈敏度較好，且能判斷寄生蟲病的感染強度，是目前診斷多種寄生蟲病的常用方法。血清學(xué)診斷雖可用于動物寄生蟲病的生前檢測，但以ELISA為代表的免疫學(xué)診斷方法，其特異性較低，在臨床上常常會出現(xiàn)交叉反應(yīng)，而且受抗原、抗體水平變化的影響，多用作輔助診斷手段而非確診。主要用于原蟲病的診斷方面，且常在其他方法不能診斷時應(yīng)用該法。用采自患病動物病料對最易感的實驗動物進行人工接種，進行疾病的復(fù)制，待蟲體在其體內(nèi)大量繁殖后再對實驗動物進行檢查，如對伊氏錐蟲病和弓形蟲病的實驗室診斷可采用此法。B型超聲檢查對各類囊蟲病、包蟲病和阿米巴肝膿腫等的診斷及定位具有重要意義。肝臟CT掃描對肝臟包蟲病，頭顱CT掃描或MRI對腦囊蟲病、腦弓形蟲病、腦包蟲病等病的診斷及鑒別診斷具有重要價值?？煞譃槿硇云蕶z、個別系統(tǒng)剖檢及個別器官剖檢等。尸體剖檢可以查明動物所有器官組織中的寄生蠕蟲，包括生前診斷法所不能查出的蟲