擬南芥插入突變體鑒定

遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告擬南芥T-DNA插入突變體的PCR鑒定【摘要】擬南芥的T-DNA插入變異是反向遺傳學(xué)進(jìn)行植物生物學(xué)研究的重要手段之一。實(shí)驗(yàn)將獲得T-DNA插入某基因造成的突變種，插入基因功能進(jìn)行判斷。篩選出純種突變型，同時(shí)進(jìn)行PCR法序列鑒定純種突變型、雜種突變型與野生型。1.引言：反向遺傳學(xué)：經(jīng)典遺傳學(xué)是從生物的性狀、表型到遺傳物質(zhì)來(lái)研究生命的發(fā)生與發(fā)展規(guī)律。反向遺傳學(xué)則是是在獲得生物體基因組全部序列的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)靶基因進(jìn)行必要的加工和修飾，如定點(diǎn)突變、基因插入\缺失、基因置換等，再按組成順序構(gòu)建含生物體必需元件的修飾基因組，讓其裝配出具有生命活性的個(gè)體，研究生物體基因組的結(jié)構(gòu)與功能，以及這些修飾可能對(duì)生物體的表型、性狀有何種影響等方面的內(nèi)容。與之相關(guān)的研究技術(shù)稱為反向遺傳學(xué)技術(shù)。實(shí)驗(yàn)材料擬南芥：擬南芥又稱為阿拉伯芥，是一種十字花科植物，廣泛用于植物遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)和分子生物學(xué)的研究，已成為一種典型的模式植物，其原因主要基于該植物具有以下特點(diǎn)：①植株形態(tài)個(gè)體小，高度只有30cm左右，1個(gè)茶杯可種植好幾棵；②生長(zhǎng)周期快，每代時(shí)間短，從播種到收獲種子一般只需6周左右；③種子多，每株每代可產(chǎn)生數(shù)千粒種子；④形態(tài)特征簡(jiǎn)單，生命力強(qiáng)，用普通培養(yǎng)基就可作人工培養(yǎng)；⑤基因組小，只有5對(duì)染色體；⑥擬南芥是自花受粉植物，基因高度純合，用理化因素處理突變率很高，容易獲得各種代謝功能的缺陷型。擬南芥全部基因組測(cè)序已經(jīng)完成，每個(gè)單倍染色體組（n=5）的總長(zhǎng)只有7000萬(wàn)個(gè)堿基對(duì)（只有小麥染色體組長(zhǎng)的1/80），預(yù)測(cè)共有29,454個(gè)基因。這樣科學(xué)家就可以準(zhǔn)確定位插入DNA的位置。突變體獲得：插入誘變（insertionalmutagenesis），即將外源DNA隨機(jī)插入到擬南芥基因組中，獲得突變體。當(dāng)外源DNA“擊中”某一基因時(shí)，這個(gè)特定基因就被關(guān)閉。常用的插入誘變方法為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。Ti質(zhì)粒是土壤農(nóng)桿菌的天然質(zhì)粒，質(zhì)粒上有一段特殊的DNA區(qū)段，當(dāng)農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞時(shí)，該DNA區(qū)段能自發(fā)轉(zhuǎn)移，插入植物染色體DNA中，Ti質(zhì)粒上的這一段能轉(zhuǎn)移的DNA被叫做T-DNA。根據(jù)這一現(xiàn)象，將Ti質(zhì)粒進(jìn)行改造，將感興趣的基因放進(jìn)T-DNA區(qū)段中，可通過(guò)農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)外源基因?qū)χ参锏倪z傳轉(zhuǎn)化。T-DNA插入到植物染色體上的位置是隨機(jī)的。如果T-DNA插入某個(gè)功能基因的內(nèi)部，特別是插入到外顯子區(qū)，將造成基因功能的喪失。利用農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，是獲得植物突變體的一種重要方法。特定基因突變體的獲得：北卡羅萊納州立大學(xué)的遺傳學(xué)助理教授JoseAlonso博士的研究小組創(chuàng)造出分別敲除某個(gè)基因的不同擬南芥品系。這些擬南芥的種子保存在俄亥俄州立大學(xué)擬南芥生物資源中心的種子貯存中心?，F(xiàn)在，特異性敲除基因的擬南芥種子庫(kù)已經(jīng)創(chuàng)建，向全世界的科研人員開放。研究一個(gè)特定基因的研究人員可以迅速、便利地在種子文庫(kù)中搜索該基因被關(guān)閉的擬南芥品系，然后向擬南芥生物資源中心訂購(gòu)。三引物法鑒定T-DNA插入突變體：三引物法的原理下圖所示，即采用三引物(LP、RP、BP)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。野生型植株目的基因的兩條染色體上均未發(fā)生T-DNA插入，所以其PCR產(chǎn)物僅有1種，分子量約1100bp(即從LP到RP)；純合突變體植株目的基因的兩條染色體上均發(fā)生T-DNA插入，T-DNA本身的長(zhǎng)度約為25kb，過(guò)長(zhǎng)的模板會(huì)阻止目的基因特異擴(kuò)增產(chǎn)物的形成，所以也只能得到1種以BP與LP或RP為引物進(jìn)行擴(kuò)增的產(chǎn)物，分子量約為560-860bp；雜合突變體植株只在目的基因的一條染色體上發(fā)生了T-DNA插入，所以PCR擴(kuò)增后可同時(shí)得到兩種產(chǎn)物。上述3種情況的電泳結(jié)果差異明顯，能有效區(qū)分不同基因型的植株。此法優(yōu)點(diǎn)是可同時(shí)鑒定出純合突變體并確證T-DNA的插入情況。雙引物法的基本原理與三引物法相似，只是需要急性兩輪PCR擴(kuò)增。一組以基因組DNA特異引物L(fēng)P和RP擴(kuò)增目的基因片段；另一組以T-DNA的特異引物BP與LP或RP組成一對(duì)引物，擴(kuò)增目的基因T-DNA插入片段。此法的不足之處是完成最終鑒定需進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增。由于三引物法容易導(dǎo)致PCR反應(yīng)體系的引物濃度過(guò)高，形成引物二聚體或形成非特異性擴(kuò)增，導(dǎo)致結(jié)果不理想，所以采用二引物法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。圖一：三引物法原理圖瓊脂糖凝膠電泳：DNA含有PO43-基團(tuán)，在pH8.0Buffer中帶負(fù)電,在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。自由電泳時(shí)，由于不同大小的DNA片段的電荷密度大致相同，各核酸分子難以分開；選用適當(dāng)濃度的瓊脂糖凝膠作為支持物，使之具備一定的孔徑，即可發(fā)揮分子篩效應(yīng)，使大小不同的核酸片段遷移率出現(xiàn)較大差異，達(dá)到分離的目的；DNA經(jīng)溴乙錠（EB）染色，溴乙錠可以插入DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)兩個(gè)堿基之間，與核酸形成絡(luò)合物，在紫外（300nm,360nm）激發(fā)下，產(chǎn)生桔黃色熒光（590nm可見光）。這樣就可對(duì)DNA的分離情況進(jìn)行直接觀察。2.實(shí)驗(yàn)方法：2.1DNA提?。?.1.1用液氮將100mg幼嫩葉片研磨成細(xì)粉，置于1.5ml離心管中加入預(yù)熱至65℃的600μl的2×CTAB提取液，輕搖混勻。2.1.265℃水浴30min，其間輕搖混勻。2.1.3加入等體積的氯仿/異戊醇（24：1），室溫下輕輕混勻10min，12000rpm離心15min，再轉(zhuǎn)移上清入新管。2.1.4向上清液中加入2倍無(wú)水乙醇或等體積的異丙醇，小心混勻，-20℃下30min，12000rpm離心15min，棄上清。2.1.5用70%乙醇洗滌沉淀一次，12000rpm稍離心，棄上清。2.1.6將沉淀晾干(37℃3-5min),加20-50μlTE(pH8.0，加入量視DNA的量而定)，65℃水浴30min溶解DNA。2.2PCR擴(kuò)增：PCR有變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟，選取適當(dāng)?shù)腜CR體系對(duì)提取的DNA進(jìn)行擴(kuò)增。表一：PCR反應(yīng)體系試劑加量（μl）加量（μl）加量（μl）ddH2O15161610×Tapbuffer(Mg2+free)2.52.52.5MgCl2（25mM）222模板DNA（30-50ng/ul）222引物L(fēng)P（10um）11引物RP（10um）11引物BP（10um）111dNTP(各2.5mM)0.50.50.5Tap酶（5U/ul）0.20.20.2反應(yīng)體系總體積252525表二：PCR擴(kuò)增程序過(guò)程溫度/℃35次循環(huán)35次循環(huán)預(yù)變性945min變性9440s退火5350s延伸7280s延伸后處理7210min2.3瓊脂糖凝膠電泳：選用適當(dāng)濃度的瓊脂糖凝膠作為支持物，電泳分離不同大小的DNA片段；同樣條件對(duì)Maker電泳，起到鑒定的作用。經(jīng)溴乙錠（EB）染色后在紫外燈下觀察條帶的有無(wú)及分離情況。3.實(shí)驗(yàn)用品：3.1實(shí)驗(yàn)材料擬南芥3.2實(shí)驗(yàn)試劑CATB法提取DNA：液氮、2×CTAB抽提緩沖溶液、氯仿：異戊醇=24：1、無(wú)水乙醇、70%乙醇、TEPCR：ddH2O、Buffer、MgCl2、dNTP、引物（LP、RP、BP）、DNA模版、TaqDNA聚合酶電泳：瓊脂糖、Maker、Buffer、EB、TAE3.3實(shí)驗(yàn)器具恒溫水浴鍋，離心機(jī)、離心管、移液槍、PCR儀、電泳儀、紫外燈、冰箱、液氮罐、鑷子實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析：Maker22號(hào)40號(hào)BPRP3引物BPRP3引物描述分析：我選取的擬南芥是第22號(hào)和第40號(hào)。從電泳圖可以看出，22號(hào)的三引物的PCR產(chǎn)物幾乎沒有，40號(hào)的三引物PCR產(chǎn)物條帶有多條，應(yīng)該是發(fā)生了干擾，兩株植物都不能通過(guò)三引物法準(zhǔn)確鑒定出是野生型還是純合突變體還是雜合突變體。從雙引物的電泳結(jié)果可以看出，22號(hào)和40號(hào)都有1000bp左右的大帶和750bp左右的小帶，說(shuō)明不僅擴(kuò)增出了目的基因還擴(kuò)增出了插入片段，從而說(shuō)明22號(hào)和40號(hào)擬南芥都是雜合突變體。最下面的亮帶是引物二聚體。5.實(shí)驗(yàn)總結(jié)及注意事項(xiàng)本次實(shí)驗(yàn)的效果比較理想，成功地鑒定出了22號(hào)和40號(hào)植株為雜合突變體。本次試驗(yàn)，我們學(xué)習(xí)了植物基因組的提取，在植物基因組的提取過(guò)程中，關(guān)鍵步驟是要破裂細(xì)胞壁，并將植物細(xì)胞中除DNA、RNA以外的雜質(zhì)及蛋白質(zhì)去除干凈。這就需要在有機(jī)溶劑萃取的步驟中注意適當(dāng)?shù)膶⒁后w搖勻，并且在分層的液體中吸上清液時(shí)切不可將中間的白色膜狀物質(zhì)及下層綠色液體吸出。學(xué)習(xí)了PCR擴(kuò)增技術(shù)，在PCR操作過(guò)程中，PCR反應(yīng)體系中有合適的引物并且各組分的比例適當(dāng)才能保證獲得理想的特異性擴(kuò)增結(jié)果。DNA模板純度要足夠，蛋白質(zhì)、多糖、酚類等雜質(zhì)會(huì)抑制PCR反應(yīng)，模板要保持完整性，模板降解會(huì)導(dǎo)致PCR擴(kuò)增無(wú)產(chǎn)物，濃度適當(dāng)，加量過(guò)多導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增增加；引物最重要的是其特異性，長(zhǎng)度適當(dāng)、避免二級(jí)結(jié)構(gòu)和二聚體，保持完整性，避免反復(fù)凍融，濃度應(yīng)適當(dāng)，過(guò)高導(dǎo)致非特異性增加，過(guò)低則擴(kuò)增產(chǎn)物太少；Buffer的pH、鹽離子濃度要合適，另外添加適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑和增強(qiáng)劑；Mg2＋主要是抑制DNA酶的活性，其濃度要適當(dāng)，過(guò)高非特異性嚴(yán)重，過(guò)低無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物；dNTP濃度適當(dāng)，過(guò)高則非特異性擴(kuò)增增加，過(guò)低則PCR產(chǎn)物偏低，避免反復(fù)凍融；ddH2OpH值適當(dāng)，避免污染；DNA聚合酶純度要足夠高，并且熱穩(wěn)定性要好。由于實(shí)驗(yàn)時(shí)各組分的量都比較少，因此操作添加時(shí)一定要準(zhǔn)確，可將液體加到管壁上再離心混合均勻。在瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)中，首先要學(xué)會(huì)根據(jù)點(diǎn)樣的DNA片段的大小選擇合適的瓊脂糖濃度及Marker。操作過(guò)程中要注意規(guī)范，點(diǎn)樣時(shí)既要注意不能把點(diǎn)樣孔戳穿又要注意點(diǎn)樣不能太過(guò)上以免樣品側(cè)漏。EB染色時(shí)注意保護(hù)好自己，切不能粘在皮膚上。參考資料：[1]馬藝沔毛國(guó)紅湯文強(qiáng)宋水山利用三引物PCR和同尾酶連接的策略實(shí)現(xiàn)多基因片段的重組河北省科學(xué)院學(xué)報(bào)2004,21(3):57-61[2]阮燕曄張瑩