激光共聚焦顯微鏡技術(shù)

激光共聚焦顯微鏡技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用概況：激光共聚焦顯微鏡（LSCM）是八十年代問(wèn)世的一種新型分析儀器，因?yàn)槠涓弑鎰e率，高敏捷度，高放大率等特點(diǎn)，在細(xì)胞水平上能作多種功能測(cè)量和分析，成為分析細(xì)胞學(xué)的主要研究工具；激光掃描共焦顯微鏡是在顯微鏡基礎(chǔ)上配置激光光源，掃描裝置，共軛聚焦裝置和檢測(cè)系統(tǒng)而形成的新型顯微鏡；它對(duì)活細(xì)胞分層掃描后得到光學(xué)切片，可進(jìn)行細(xì)胞三維重建。測(cè)量分析細(xì)胞形態(tài)學(xué)參數(shù)和熒光強(qiáng)度；利用熒光探針標(biāo)識(shí)LSCM能夠?qū)?xì)胞內(nèi)微細(xì)構(gòu)造和離子的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行定性、定量、定時(shí)和定位分析；LSCM能夠進(jìn)行顯微手術(shù)，細(xì)胞分選，細(xì)胞胞間通訊和膜的流動(dòng)性等測(cè)量。它的應(yīng)用前景非常廣泛，將為生物醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)領(lǐng)域的科研工作提供新的手段。LSCM的發(fā)展簡(jiǎn)況：

1971年美國(guó)Davidovits和Egger發(fā)明了以激光為光源的透鏡掃描系統(tǒng)，1978年Sheppard等推出了載物臺(tái)掃描裝置。1979年有了樣品掃描裝置，1980年Koestert等簡(jiǎn)介了鏡掃描系統(tǒng)，1983到1986年，Aslund和Carlsson等簡(jiǎn)介了雙鏡掃描系統(tǒng)和共軛聚焦成象系統(tǒng)。1984年第一臺(tái)LSCM實(shí)用產(chǎn)品問(wèn)世，十?dāng)?shù)年來(lái)LSCM的應(yīng)用有了飛速發(fā)展。產(chǎn)品主要來(lái)自四家企業(yè)，德國(guó)的Zeiss和Leica企業(yè)，日本的Olympus和Nikon企業(yè)。LSCM的基本原理一般光學(xué)顯微鏡使用的鹵素?zé)艄庠礊榛旌瞎?，光譜范圍寬，成象時(shí)樣品上每個(gè)照光點(diǎn)均會(huì)受到色差影響以及由照射光引起的散射和衍射的干擾，影響成象質(zhì)量；LSCM的光源為激光，單色性好，基本消色差，成象聚焦后焦深小，縱向辨別率高，可對(duì)樣品作不同深度的層掃描和熒光強(qiáng)度測(cè)量，不同焦平面的光學(xué)切片經(jīng)三維重建后能得到樣品的三維立體構(gòu)造，這種功能被形象的稱為“顯微CT”。利用放置在光源后的照明針孔和放置在檢測(cè)器前的探測(cè)針孔實(shí)現(xiàn)點(diǎn)照明和點(diǎn)探測(cè)，來(lái)自光源的光經(jīng)過(guò)照明針孔發(fā)射出的光聚焦在樣品焦平面的某個(gè)點(diǎn)上，該點(diǎn)所發(fā)射的熒光成像在探測(cè)針孔上，該點(diǎn)以外的任何發(fā)射光均被探測(cè)針孔阻擋。照明針孔與探測(cè)針孔對(duì)被照射點(diǎn)或被探測(cè)點(diǎn)來(lái)說(shuō)是共軛的，所以被探測(cè)點(diǎn)即共焦點(diǎn)，被探測(cè)點(diǎn)所在的平面即共焦平面。LSCM的構(gòu)造特點(diǎn)LSCM由顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)，激光光源，掃描裝置和檢測(cè)系統(tǒng)構(gòu)成，整套儀器由計(jì)算機(jī)控制，各部件之間的操作切換都可在計(jì)算機(jī)操作平臺(tái)界面中以便靈活地進(jìn)行。顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)

顯微鏡是LSCM的主要組件，它關(guān)系到系統(tǒng)的成象質(zhì)量。一般有倒置和正置兩種形式，前者在活細(xì)胞檢測(cè)等生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中使用更廣泛。顯微鏡物鏡應(yīng)選用大數(shù)值孔徑平場(chǎng)復(fù)消色差物鏡為好，有利于熒光的采集和成象的清楚。物鏡組的轉(zhuǎn)換，濾色片組的選用，載物臺(tái)的移動(dòng)調(diào)整，焦平面的記憶鎖定都應(yīng)由計(jì)算機(jī)自動(dòng)控制。多功能顯微鏡以德國(guó)的蔡司Zeiss和萊卡Leica的產(chǎn)品為好，也常用日本的尼康Nikon或奧林巴斯Olympus產(chǎn)品。LSCM的構(gòu)造特點(diǎn)掃描裝置LSCM使用的掃描裝置有兩類，臺(tái)掃描系統(tǒng)和鏡掃描系統(tǒng)。目前也有兩者結(jié)合使用的儀器。臺(tái)掃描經(jīng)過(guò)步進(jìn)馬達(dá)驅(qū)動(dòng)載物臺(tái)，位移精度可達(dá)0.lμm，能夠有效地消除成象點(diǎn)橫向象差，使樣品信號(hào)強(qiáng)度不受探測(cè)位置的影響，可精擬定位定量地掃描檢測(cè)視野中每一物點(diǎn)的光強(qiáng)度，缺陷是載物臺(tái)機(jī)械移動(dòng)、圖象采集速度較慢。鏡掃描有雙鏡掃描和單鏡掃描兩種，通轉(zhuǎn)鏡完畢對(duì)樣品的掃描。因?yàn)檗D(zhuǎn)鏡只需偏轉(zhuǎn)很小角度就能涉及很大的掃描范圍，圖象采集速度大大提升，512×512畫(huà)面每秒可達(dá)4幀以上，有利于那些壽命短的離子作熒光測(cè)定，但因光路略有偏轉(zhuǎn)會(huì)對(duì)通光效率和象差有所影響。掃描系統(tǒng)的工作程序由計(jì)算機(jī)自動(dòng)控制。

LSCM的構(gòu)造特點(diǎn)激光光源

LSCM使用的激光光源有單激光和多激光系統(tǒng)。氪氬離子激光器是可見(jiàn)光范圍內(nèi)使用的多光譜激光，發(fā)射波長(zhǎng)488nm、568nm和647nm分別為藍(lán)光、綠光和紅光，大功率氬離子激光器是紫外和可見(jiàn)光混合激光器，發(fā)射波長(zhǎng)為351－364nm、488nm和514nm分別為紫外光、藍(lán)光和綠光，單個(gè)激光優(yōu)點(diǎn)是安裝以便，光路簡(jiǎn)樸，但價(jià)格較貴并存在不同激光之間的光譜競(jìng)爭(zhēng)和色差校正問(wèn)題。多激光器系統(tǒng)在可見(jiàn)光范圍使用氬離子激光器，發(fā)射波長(zhǎng)為

488nm和514nm的藍(lán)綠光，氦氖激光器發(fā)射波長(zhǎng)為633nm的紅光，紫外光選用氬離子激光器，波長(zhǎng)為351－364nm。其優(yōu)點(diǎn)是各譜線激光單獨(dú)發(fā)射，不存在譜線競(jìng)爭(zhēng)的干擾，調(diào)整以便。檢測(cè)系統(tǒng)

LSCM為多通道熒光采集系統(tǒng)，光路上要求至少有三個(gè)熒光通道和一種透射光通道，如有第四熒光通道愈加好，可對(duì)物體進(jìn)行多譜線激光激發(fā)，樣品發(fā)射熒光的探測(cè)器為感光敏捷度高的光電倍增管PMT。LSCM的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用

熒光檢測(cè)制作和分析有熒光標(biāo)識(shí)的樣品是既費(fèi)時(shí)又費(fèi)力的工作。采用多熒光，您能夠使用多種標(biāo)識(shí)同步研究細(xì)胞構(gòu)造。另外，多熒光試驗(yàn)是直接研究分子和其他細(xì)胞成份之間關(guān)系的唯一工具。GL-50PD-L1PD-L2CD83CD80CD86

CD40MergeCD40Merge

B7H4LightCD25CD132Merge(CD25CD132)Pearsonr=0.80

CD25CD122

Merge(CD25CD122)Pearsonr=0.79細(xì)胞定量熒光測(cè)定

顯微熒光光度計(jì)因?yàn)轱@微鏡和激發(fā)光源的限制成象模糊，只能測(cè)定細(xì)胞內(nèi)的熒光總量，有一定的誤差。LSCM以激光為光源，對(duì)細(xì)胞分層掃描，單獨(dú)測(cè)定，經(jīng)積分后能得到細(xì)胞熒光的精擬定量，反復(fù)性極佳。它適于活細(xì)胞的定量分析，可測(cè)定細(xì)胞內(nèi)溶酶體、線粒體、DNA含量、RNA含量、酶和構(gòu)造性蛋白質(zhì)等物質(zhì)含量和分布，常用于原位分子雜交，腫瘤細(xì)胞辨認(rèn)，單個(gè)活細(xì)胞水平的DNA損傷及修復(fù)的定量分析。它適于迅速高敏捷度測(cè)量，降低光粹滅的影響，在定量免疫熒光測(cè)定方面應(yīng)用廣泛，如作多種腫瘤組織切片抗原體現(xiàn)的定量分析，監(jiān)測(cè)腫瘤有關(guān)抗原體現(xiàn)的定位定量信息，監(jiān)測(cè)藥物對(duì)肌體免疫功能的作用，監(jiān)測(cè)本身免疫性疾病的多種抗原及藥物對(duì)肌體免疫功能的作用，監(jiān)測(cè)細(xì)胞結(jié)合和殺傷的形態(tài)特征并作定量分析等。細(xì)胞定量熒光測(cè)定可選用單熒光、雙熒光和三熒光方式，能自動(dòng)測(cè)定細(xì)胞面積，平均熒光強(qiáng)度，積分熒光強(qiáng)度及形狀因子等多種參數(shù)。

細(xì)胞的三維重建

一般熒光顯微鏡辨別率低，顯示的圖象構(gòu)造為多層面的圖象迭加，構(gòu)造不夠清楚。LSCM能以0.1μm的步距沿軸向?qū)?xì)胞進(jìn)行分層掃描，得到一組光學(xué)切片，經(jīng)A／D轉(zhuǎn)換后作為二維數(shù)組貯存。這些數(shù)組經(jīng)過(guò)計(jì)算機(jī)進(jìn)行不同的三維重建算法，可作單色圖象處理，雙色圖象處理，組合成細(xì)胞真實(shí)的三維構(gòu)造。旋轉(zhuǎn)不同角度可觀察各側(cè)面的表面形態(tài)，也可不同的斷面觀察細(xì)胞內(nèi)部構(gòu)造，測(cè)量細(xì)胞的長(zhǎng)寬高、體積和斷層面積等形態(tài)學(xué)參數(shù)。經(jīng)過(guò)模擬熒光處理算法，能夠產(chǎn)生在不同照明角度形成的陰影效果，突出立體感。經(jīng)過(guò)角度旋轉(zhuǎn)和細(xì)胞位置變化可產(chǎn)生三維動(dòng)畫(huà)效果。LSCM的三維重建廣泛用于各類細(xì)胞骨架和形態(tài)學(xué)分析，染色體分析，細(xì)胞程序化死亡的觀察，細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器的構(gòu)造變化的分析和探測(cè)等方面。Cellculture,3Dshadowprojectionshowingtightjunctions(red)andcytoskeletonstructures(green)Mitose-Tubulin(FITC),DNA(PJ)

細(xì)胞內(nèi)鈣離子PH值和其他離子的

動(dòng)態(tài)分析

經(jīng)過(guò)Indo－1、Fluo－2、Fluo－3、Calcium

green、SNARF等多種熒光探針，可對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子、鈉離子及PH值等作熒光標(biāo)識(shí)并對(duì)它們進(jìn)行比率值和濃度梯度變化測(cè)定。因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)鈣離子為傳遞信息的第二信使，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)分化起著主要作用，經(jīng)過(guò)單標(biāo)識(shí)或雙標(biāo)識(shí)對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子和其他離子的熒光強(qiáng)度和分布精確測(cè)定，測(cè)定樣品達(dá)成毫秒級(jí)的迅速變化。借助光學(xué)切片功能能夠測(cè)量樣品深層的熒光分布以及細(xì)胞光學(xué)切片的生物化學(xué)特征的變化。經(jīng)過(guò)不同步間段的檢測(cè)可測(cè)定細(xì)胞內(nèi)離子的擴(kuò)散速率，了解它對(duì)腫瘤開(kāi)啟因子、生長(zhǎng)因子等刺激的反應(yīng)。細(xì)胞內(nèi)離子測(cè)量廣泛用于腫瘤研究、組織胚胎學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和藥理學(xué)等領(lǐng)域。管狀唾腺切片中鈣濃度的變化用F/F0來(lái)展示。F/F0則用假色來(lái)表達(dá)，蘭色表達(dá)鈣含量低，紅色表達(dá)鈣含量高。熒光光漂白恢復(fù)（FRAP和FLIP）

什么是FRAP？FRAP(光漂白后熒光恢復(fù))就是在光漂白后對(duì)樣本擬定區(qū)中的熒光恢復(fù)。FRAP是由沒(méi)有漂白的熒光團(tuán)由周圍進(jìn)入漂白區(qū)FRAP的運(yùn)動(dòng)引起的。FRAP用于測(cè)量2-維或3-維分子運(yùn)動(dòng)的力度。分子運(yùn)動(dòng)涉及膜或活細(xì)胞內(nèi)用熒光標(biāo)明的分子的擴(kuò)散、轉(zhuǎn)移或其他類型的運(yùn)動(dòng)。什么是FLIP？FLIP（光漂白中的熒光損失）是一種鄰近反復(fù)漂白區(qū)的被定義區(qū)域內(nèi)熒光的降低或消失。與FRAP一樣，F(xiàn)LIP被用來(lái)測(cè)量膜或活細(xì)胞內(nèi)分子運(yùn)動(dòng)的力度。FRAP原理在進(jìn)行FRAP試驗(yàn)時(shí)，一種區(qū)域（如用熒光作標(biāo)志的細(xì)胞表面）用低激光強(qiáng)度成像。所以，高強(qiáng)度鼓勵(lì)光脈沖被用來(lái)對(duì)定義的區(qū)域進(jìn)行強(qiáng)烈漂白，如衍射限制點(diǎn)、小漂白R(shí)OI、視場(chǎng)內(nèi)平行光帶的直線型。最終，在漂白區(qū)域的恢復(fù)時(shí)間過(guò)程采用模糊鼓勵(lì)激光束來(lái)監(jiān)控。成果是，F(xiàn)RAP闡明任何類型的熒光分子運(yùn)動(dòng)（被動(dòng)的，如擴(kuò)散；主動(dòng)的，如移動(dòng)。）恢復(fù)時(shí)間（半恢復(fù)時(shí)間）表白了這種移動(dòng)性，如擴(kuò)散時(shí)間的速度。例子（一）EGFP-expressingmyoblastcellline

Experiment:Bleachingofthenucleus(ROI1)bypixel-preciseAOTFcontrolisfollowedbyslowEGFPflow-backfromthecytoplasm.Result:EGFPcanpassthenuclearmembrane(thenuclearporecomplex).例子（二）Experiment:Bleachingofpartsofthenuclearmembraneatt=0min

Result:Rapidrecoveryofmutantemerin-GFPfluorescenceinthebleachedareaduetohighmobilityofthemutantprotein;lowermobilitiyofthewildtypeemerin-GFPproteinbecauseofinteractionwithotherproteins.Emerin-GFPtransfectedcells,top:wildtypeemerin;bottom:emerinmutant

例子（三）LivingculturedcellexpressingGFPandaYFP-SHPfusionprotein

Experiment:Bleachingofnuclearfluorescence;InordertoseparateGFPandYFPsignals,imagedatawereacquiredasseriesofLambdaStacksandsubjectedtoEmissionFingerprinting.Intheresultingimageseries,GFPandYFParedisplayedingreenandred,respectively.Result:GFPdistributesthroughoutthecell,whileYFPconcentratesinthecytoplasm.BleachingofnuclearGFP(ROI1)isfollowedbyslowrecoveryindicatingGFPdiffusionthroughnuclearpores.FRET什么是FRET？FRET就是采用非放射性措施，在供體和受體相互靠得很近（1-10nm）時(shí)，將光子能從一種