模擬生理?xiàng)l件下膽紅素與血清白蛋白的相互作用

模擬生理?xiàng)l件下膽紅素與血清白蛋白的相互作用

圖1顯示了膽紅素的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)表示動(dòng)物體內(nèi)紅茶和其他化合物的分解代謝。血漿中有4種形式的膽紅素-Bα,Bβ,Bγ及Bδ,其中Bδ是與血清白蛋白緊密結(jié)合的膽紅素。由于膽紅素分子內(nèi)氫鍵使膽紅素具有強(qiáng)烈的親脂性,從而影響了膽紅素的代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)。在血液中,膽紅素是在白蛋白的輸送下到達(dá)肝臟而進(jìn)行進(jìn)一步的新陳代謝的。此外,膽紅素和白蛋白結(jié)合成復(fù)合體,增大膽紅素在血漿中的溶解度防止膽紅素在體內(nèi)積累導(dǎo)致黃疸。過去人們對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)合膽紅素認(rèn)識(shí)不足,近幾年來(lái),在臨床上Bδ的價(jià)值越來(lái)越受到人們的重視,特別是膽紅素被認(rèn)為是主要的生理性抗氧化劑,對(duì)細(xì)胞有保護(hù)功能,所以研究膽紅素和蛋白質(zhì)相互作用也顯得非常有意義。由于膽紅素溶液不穩(wěn)定,又易于氧化,所以現(xiàn)有的許多分析方法均有一定的局限性。國(guó)內(nèi)有關(guān)膽紅素和蛋白質(zhì)相互作用研究報(bào)道很少,而利用熒光光譜法研究膽紅素和蛋白質(zhì)的相互作用還未見報(bào)道。余藝華等人利用CHP樹脂求得了膽紅素和白蛋白復(fù)合物的解離常數(shù)。國(guó)外有一些有關(guān)利用熒光光譜法研究膽紅素和蛋白質(zhì)相互作用的報(bào)道,但也不是很多。如Humra等和SaadTayyab等利用蛋白質(zhì)對(duì)膽紅素?zé)晒庠鰪?qiáng)法研究了膽紅素和幾種血清白蛋白的相互作用,并對(duì)所得到的結(jié)合常數(shù)進(jìn)行了比較;Z.Hrkal等利用熒光猝滅法研究了膽紅素和人血清白蛋白的相互作用,但只給出了結(jié)合位點(diǎn)數(shù)及結(jié)合常數(shù)。本實(shí)驗(yàn)利用熒光猝滅法詳細(xì)地研究了在模擬生理?xiàng)l件下,膽紅素(BR)與牛血清紅白蛋白(BSA)結(jié)合作用的特征,求出了結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)、結(jié)合距離等參數(shù);并探討了膽紅素對(duì)與牛血清白蛋白構(gòu)象的影響,對(duì)進(jìn)一步了解膽紅素在血液中存在形式、儲(chǔ)存、運(yùn)輸以及作用機(jī)理等有著重要的實(shí)際意義。1實(shí)驗(yàn)部分1.10-dma貯備液的配制Cary300型熒光分光光度計(jì)(美國(guó)Varian公司);TU-1800PC紫外一可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)。0.75mol/L的NaCl水溶液;pH=7.43的三羥甲基氨基甲烷-HCl(Tris-HC1)緩沖液;1.0×10-5mol/L的牛血清白蛋白(BSA)水溶液(華美生物工程公司,純度99%);準(zhǔn)確稱取0.0117g膽紅素(中國(guó)藥品生物制品檢定所),用2mL5.0×10-2mol/L的NaOH溶液溶解,再加入2mL1.0×10-3mol/L的EDTA溶液,最后定容于100mL容量瓶中,即為2.0×10-4mol/L的膽紅素貯備液。所用試劑均為分析純,HCl為優(yōu)級(jí)純,水為亞沸蒸餾去離子水。1.2熒光光譜的測(cè)定在10mL比色管中依次加入2.0mL0.75mol/L的NaCl溶液,2.0mLTris-HCl緩沖溶液,1.0mL1.0×10-5mol/L的BSA溶液及一定量膽紅素溶液,用水定容。溶液充分混合并穩(wěn)定10min后進(jìn)行測(cè)定。以λex=285nm,在300～500nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)定BSA及BSA+BR混合溶液的熒光發(fā)射光譜。同時(shí)分別在Δλ=60nm和Δλ=15nm掃描色氨酸殘基和酪氨酸殘基的同步熒光光譜。測(cè)定熒光光譜時(shí),激發(fā)和發(fā)射單色器狹縫寬度都為5nm。測(cè)定膽紅素溶液吸收光譜時(shí),單色器狹縫寬度為1nm。只含有Tris-HCl和NaCl的空白溶液用于校正熒光和吸收背景。此外,不但所有含有膽紅素的溶液準(zhǔn)備及測(cè)定都要在避光或較暗的條件下進(jìn)行,而且必須在2h以內(nèi)完成從溶液制備到光譜測(cè)定,否則重新配制溶液。2結(jié)果與討論2.1bsa熒光跳滅光譜BSA分子中色氨酸殘基,酪氨酸殘基,苯丙氨酸殘基都能產(chǎn)生熒光,但由于分子內(nèi)非常有效的氨基酸殘基間能量轉(zhuǎn)移效應(yīng),結(jié)果觀測(cè)到的主要是色氨酸殘基熒光。而每個(gè)BSA分子中有兩個(gè)色氨酸殘基,它們分別位于第134位和212位,熒光主要由212位色氨酸殘基產(chǎn)生。圖2是用λex=285nm的光激發(fā),在相同的實(shí)驗(yàn)條件下,測(cè)得2.0×10-6mol/L的BSA熒光猝滅光譜圖。隨著膽紅素濃度的增加,BSA的熒光發(fā)射峰強(qiáng)度減弱。記錄BSA的熒光猝滅光譜在346nm處的熒光強(qiáng)度用于下面的各種計(jì)算。2.2熒光動(dòng)態(tài)符合stern-微織構(gòu)擬合方程在一定的pH、溫度和離子強(qiáng)度下,能使BSA熒光發(fā)生猝滅的原因有動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅。動(dòng)態(tài)猝滅為熒光生色基團(tuán)處于激發(fā)態(tài)時(shí)與猝滅劑而引起的猝滅。靜態(tài)猝滅有3種情況:第1種為猝滅劑與處于基態(tài)下的熒光生色基團(tuán)形成非熒光化合物而導(dǎo)致的猝滅;第2種為猝滅劑與蛋白質(zhì)結(jié)合通過誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化導(dǎo)致生色基團(tuán)周圍介質(zhì)極性改變而引起的猝滅;第3種為熒光體與猝滅體之間的無(wú)輻射能量轉(zhuǎn)移而引起的猝滅。動(dòng)態(tài)猝滅作用過程遵循Stern-Volmer方程:I0FF0/IF=1+Kqτ0[Q]=1+Ksv[Q]式中,Ksv為Stern-Volmer猝滅常數(shù);Kq為雙分子猝滅過程速率常數(shù);τ0為猝滅劑不存在時(shí)熒光體分子平均壽命;[Q]為猝滅劑的濃度;I0F為未加入猝滅劑時(shí)熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度;IF為猝滅劑濃度等于[Q]時(shí)熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度。假設(shè)猝滅是動(dòng)態(tài)猝滅。利用在溫度分別30和37℃條件下測(cè)得熒光猝滅光譜數(shù)據(jù)作體系的Stern-Volmer猝滅曲線(圖3),其對(duì)應(yīng)的線性擬合方程和相關(guān)系數(shù)等列于表1。由于生物大分子熒光平均壽命約為10-8s,所以由K=Ksv/τ0,可求得BR對(duì)BSA熒光猝滅過程的速率常數(shù)Kq。各類猝滅劑對(duì)生物大分子的最大擴(kuò)散碰撞猝滅常數(shù)為2.0×1010L·mol-1·s-1,由表2可知,BR對(duì)BSA熒光猝滅過程速率常數(shù)遠(yuǎn)大于擴(kuò)散控制的Kq,所以初步判斷應(yīng)歸于形成化合物所引起的靜態(tài)猝滅,而不是由于動(dòng)態(tài)碰撞引起的動(dòng)態(tài)猝滅。因?yàn)閯?dòng)態(tài)猝滅依賴于擴(kuò)散,所以溫度的升高會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)散系數(shù)的增大,結(jié)果熒光物質(zhì)的猝滅常數(shù)將隨溫度的升高而增大。比較圖3中分別在30和37℃溫度條件下測(cè)得的BSA的Stern-Volmer曲線,從圖中可以看出,直線斜率隨著溫度的升高呈現(xiàn)明顯地下降規(guī)律。因此,進(jìn)一步的證明BR對(duì)BSA的熒光猝滅過程應(yīng)為靜態(tài)猝滅。此外,圖2中隨著BR濃度的增加,BSA的熒光發(fā)射峰發(fā)生藍(lán)移,也是靜態(tài)猝滅的一個(gè)佐證。2.3熒光加強(qiáng)和結(jié)合位設(shè)置設(shè)BR和BSA形成具有n個(gè)等同的且獨(dú)立的結(jié)合位點(diǎn)的復(fù)合物,并且結(jié)合常數(shù)為KA,則n和KA與BSA的熒光強(qiáng)度之間符合下面公式:lg[(I0FF0-IF)/IF]=lgKA+nlg[BR]式中I0FF0和IF分別表示加和未加猝滅劑時(shí)體系的熒光強(qiáng)度;[BR]為膽紅素的濃度。固定BSA的濃度為2.0×10-4mol/L,加入不同量的BR溶液,測(cè)得熒光猝滅光譜,由lg[(I0FF0-IF)/IF]對(duì)lg[BR]作圖所得直線的斜率和截距可確定不同溫度時(shí)BR和BSA的結(jié)合常數(shù)KA和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n,結(jié)果見表2。表2中結(jié)合位點(diǎn)數(shù)近似為1,表明BR和BSA形成1∶1的復(fù)合物;而由結(jié)合常數(shù)值可推知,在人體血液中,膽紅素和血清白蛋白具有很強(qiáng)的結(jié)合,這將有助于膽紅素在血液中向肝臟的輸送。2.4br、bsa的結(jié)合關(guān)系小分子與生物大分子的作用力包括靜電作用力、氫鍵作用力、范德華作用力和疏水作用力等。不同物質(zhì)與蛋白質(zhì)結(jié)合的作用力類型也不相同。在溫度變化不大時(shí),BR和BSA的結(jié)合反應(yīng)的焓變?chǔ)可以看作常數(shù),所以可根據(jù)下面的方程求得反應(yīng)中的ΔH,ΔG和ΔS等熱力學(xué)函數(shù)的變化,結(jié)果列于表2中。ΔH=2.303RT1T2T2?T1lgKA2KA1ΔΗ=2.303RΤ1Τ2Τ2-Τ1lgΚA2ΚA1;ΔG=-RTlnKA;ΔS=ΔH?ΔGTΔS=ΔΗ-ΔGΤ式中R是摩爾氣體常數(shù);KA1和KA2分別對(duì)應(yīng)表2中溫度為30和37℃時(shí)的結(jié)合常數(shù)。從表2中ΔG<0可以推斷出BR和BSA結(jié)合反應(yīng)是一個(gè)自發(fā)過程;依據(jù)Ross總結(jié)出的判斷生物大分子與小分子結(jié)合力性質(zhì)的熱力學(xué)規(guī)律,由ΔH>0及ΔS>0,可以推斷出BR和BSA之間的作用力可能主要是疏水作用。2.5熒光直接進(jìn)入實(shí)驗(yàn)條件的重復(fù)能量轉(zhuǎn)移r0基于F?rster偶極-偶極非輻射能量轉(zhuǎn)移理論:當(dāng)供能體與受能體足夠接近,最大距離不超過7nm,并且供能體的熒光發(fā)射光譜與受能體的吸收光譜有足夠的重疊時(shí),將會(huì)發(fā)生非輻射能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象,導(dǎo)致熒光體的熒光猝滅。能量轉(zhuǎn)移效率E與熒光給體與受體間的距離r及臨界能量轉(zhuǎn)移距離R0有關(guān),且滿足下述關(guān)系式:E=1-IF/IF=R0/(R0+r)(1)式中R0是能量轉(zhuǎn)移效率為50%時(shí)的臨界距離。R06=8.8×10-25(JK2φn-4)(2)式中K2為偶極空間取向因子;n為介質(zhì)的折射指數(shù);φ為熒光給體的熒光量子產(chǎn)率;J為熒光給體的熒光發(fā)射光譜與受體的吸收光譜間的重疊積分:J=ΣF(λ)ε(λ)λ4Δλ/ΣF(λ)Δλ(3)式中F(λ)為熒光給體在波長(zhǎng)λ處的熒光強(qiáng)度;ε(λ)為受體在波長(zhǎng)λ處的摩爾吸光系數(shù)。利用圖4中在30℃溫度條件下測(cè)得的BSA的熒光發(fā)射光譜圖和BR的吸收光譜圖,根據(jù)式(3),可求得光譜的重疊積分J=3.904×10-15cm3·L·mol-1。在本實(shí)驗(yàn)條件下,取向因子K2取熒光給體和受體隨機(jī)分布的平均值2/3;BSA中色氨酸殘基量子效率φ=0.13;折射指數(shù)n取水和有機(jī)物的平均值1.336。將上述數(shù)值代入式(2),計(jì)算得出R0=2.13nm;能量轉(zhuǎn)移效率E由BR與BSA的濃度比為1∶1的混合液熒光猝滅結(jié)果按式(1)求得E=0.578;最后把R0值和E值代入式(1),求得BSA分子中色氨酸殘基與BR的作用距離為r=2.02nm。r<7nm,表明非輻射能量轉(zhuǎn)移是引起熒光猝滅的原因之一;而r<R0,意味著非輻射能量轉(zhuǎn)移引起B(yǎng)SA熒光猝滅的幾率較大。2.6br對(duì)bsa的熒光光譜的影響對(duì)于蛋白質(zhì)的同步熒光,Δλ=6