馬鈴薯卷葉病毒的提取純化研究

馬鈴薯卷葉病毒的提取純化研究

由馬蹄卷葉病毒（plfv）引起的甘薯黃疸、低度收縮、卷葉、僵硬和塊狀壞死。這是大多數(shù)甘薯病的類型。我國南、北方一些馬鈴薯主要栽培品種均感染有此病毒病。由于PLRV嚴(yán)格蟲傳,主要存在于寄生植物維管束韌皮部細(xì)胞中,難于大量提純等原因,長期以來這一病毒的研究進(jìn)展緩慢。提取PLRV最早成功之例是1967年P(guān)eters從蚜蟲體內(nèi)獲得了少量純化的PLRV粒體。1969年Kojima第一次成功地從感病洋酸漿組織中提取到了較多的PLRV粒體。其后Murayama和Kojima,Sarkat,Maat和Debokx,Gugerli,Smith,Takanami等分別從馬鈴薯或洋酸漿組織中部分純化了PLRV。他們的純化程序大致都是將病組織于緩沖液中勻漿,以氯仿-正丁醇混合物變性植物蛋白,一次PEG沉淀病毒,而后經(jīng)一次或兩次差速離心,最后用蔗糖密度梯度離心分離。由于PLRV存在于植物的韌皮部細(xì)胞中,按照常規(guī)的粗汁液提取方法不一定能將植物組織韌皮部細(xì)胞中的病毒充分提取出來,Takanami等將植物組織于28℃的條件下用酶消化,從而使病毒充分地釋放出來,得到大量的PLRV。但是由于提取過程中要將植物組織和酶于28℃下作用兩小時,這樣對提取到的PLRV活性難免有一些影響。在病毒的粗提過程中,為了提高病毒的純度,一些學(xué)者采用兩次激烈的蛋白變性劑去除植物蛋白,這或多或少會影響病毒的產(chǎn)量。為制備大量高效價的特異性多克隆及單克隆抗血清,進(jìn)一步研究病毒的化學(xué)組分,或分離病毒的基因組,都需有足夠量的高純度病毒制劑。我們在Smith,Kojima以及Sarkar等提純方法的基礎(chǔ)上,采用液氮冷凍、一步提取法徹底破碎植物組織細(xì)胞,以充分釋放病毒,采用SephadexG-200分子篩過濾法初步純化PLRV;再用蔗糖密度梯度離心進(jìn)一步提純,提高了病毒的產(chǎn)量和純度。初步建立了一個改進(jìn)的、行之有效的馬鈴薯卷葉病毒提純程序。制備冷-1-pb-1-雙酰甲基-1,3,5.2.3.4和5.2%基乙醇2.2.2.2.2.2.4和5.2.4.4.4冷液、5.4.4.4和5.4.4.4.4和5.4.4.4.4和5.4.4.4.4.4和5.4.4.4.4.4.4.5%peg分離.PLRV來源于內(nèi)蒙古大學(xué)溫室中保存的馬鈴薯.此病毒系張鶴齡等從馬鈴;292-20分離鑒定的.用桃蚜(Myzuspersicae)作為傳毒媒介.此蚜蟲系春季采自桃樹上,并轉(zhuǎn)接到蘿卜或白菜上增殖.待幼蚜繁殖出來時立即轉(zhuǎn)接到另外的無毒白菜或蘿卜上增殖,用于飼毒.用洋酸漿(Physalisfloridana)作為增殖材料.將在白菜或蘿卜上增殖的無毒無翅蚜蟲,轉(zhuǎn)到上述感染有PLRV的馬鈴薯小苗上飼毒3天,再轉(zhuǎn)接到洋酸漿幼苗上,每株幼苗接種3～5頭,傳毒3天,而后以殺蟲劑殺死蚜蟲.將傳毒后的植物于23～30℃的溫室中培養(yǎng)20～30天,待出現(xiàn)典型的病癥時收集材料,凍存于-20℃?zhèn)溆?主要參照Smith的提純方法,取上述凍存病源材料500g,加入2000ml冷的0.5MpH7.4的PB,內(nèi)含10mM/1EDTA和0.1%巰基乙醇,于攪肉機(jī)上攪碎兩次,組織勻漿器上勻漿,兩層紗布濾渣.于汁液中加入三分之一汁液體積的冷氯仿-正丁醇(1:1)混合物,在冰浴中攪拌乳化1小時,4.C靜置1小時,3500r/min離心25分鐘澄清.于上清中加入7%(W/V)PEG(MW6000)置4.C2小時.9000r/min離心30分鐘收集沉淀.以1/3原汁液體積冷的0.07M,pH7.4PBk回溶,9000r/min離心12分鐘以澄清.于上清液中再加入7%PEG和2%NaCl進(jìn)行二次PEG沉淀,同上收沉淀及澄清。將上述澄清液加在含有20%蔗糖墊層的離心管中(5ml/管),31000r/min(MSE-75,8×50ml)離心2.5小時,沉淀回溶于0.07MpH7.4PBk中,9000r/min離心15分鐘澄清,其上清再加于含于20%蔗糖墊層的離心管中(1ml/管),46000r/min離心3小時,回溶沉淀于0.07MpH7.6PBk中,高速離心澄清.將差速離心后得到的病毒懸液(不超過2ml)加在裝有水冷系統(tǒng)的、事先以0.07MpH7.4PBk(含0.1%NaN,)平衡的SephadexG-200柱上,進(jìn)一步分離純化(柱高50cm,直徑1.5c).洗脫液同平衡液,收集1ml/管.將兩次差速離心之后得到的病毒懸液,進(jìn)行蔗糖密度梯度離心.梯度為10～40%蔗糖,用0.01MpH7.5PBk配制,于MSE-75離心機(jī)上(3×4ml水平轉(zhuǎn)頭)30000r/min離心2.5小時.把上述500g感染有PLRV的酸漿經(jīng)提取后的剩渣,用紗布包好放液氮冷凍,而后取出置石臼中迅速砸成粉末,反復(fù)2～3次,以冷的8000ml0.2MpH7.4PBk(內(nèi)含10mM/1EDTA和1%巰基乙醇)攪拌提取30分鐘.以下的病毒粗提取及進(jìn)一步純化同前.每克感病植物組織加2ml冷的0.5MpH7.4PBk(內(nèi)含10mM/1EDTA和0.1%巰基乙醇)和2ml冷的氯仿,于組織搗碎機(jī)上混合勻漿7分鐘,而后5000r//min離心30分鐘澄清.PEG沉淀、蔗糖墊層差速離心等純化病毒的步驟及條件同前.(十)張間血清學(xué)及致病性測定電鏡樣品的制備:各取差速離心、墊層差速離心、SephadexG-200柱分離以及蔗糖密度梯度離心分離得到的病毒樣品一滴,加在噴碳加固的火棉膠電鏡銅網(wǎng)膜上,負(fù)染,干燥,電鏡觀察.血清學(xué)檢驗(yàn):用內(nèi)蒙古大學(xué)生物系張鶴齡等制備的PLRV特異性抗血清以及正常植物蛋白抗血清通過瓊脂雙擴(kuò)散法,對流免疫電泳法對提純的PLRV進(jìn)行檢驗(yàn).侵染性實(shí)驗(yàn):將在白菜上增殖的無毒蚜蟲(MyzusPerscae)饑餓6小時后進(jìn)行薄膜飼毒.所用薄膜為PalafilmM,飼毒液為含20%蔗糖的純化PLRV懸液。飼毒后的蚜蟲轉(zhuǎn)接到洋酸漿小苗及馬鈴薯幼苗上,每株4～5頭,罩上網(wǎng)罩。3天后以殺蟲劑殺死蚜蟲,接種植物,25℃培養(yǎng)10～20天觀察癥狀.結(jié)果一、度大型度為了探明蔗糖墊層差速離心對純化病毒的作用,所以同時與無蔗糖墊層差速離心對比。試驗(yàn)結(jié)果表明通過蔗糖墊層差速離心病毒的純度明顯增高。OD260/280和260/240比值由無蔗糖墊層差速離心的1.2和0.8提高到1,31和1.14。無墊層差速離心得到的提取物其紫外吸收沒有顯示出病毒特有的吸收曲線,而墊層差速離心得到的提取物則初步顯示出病毒特有的吸收曲線。無墊層差速離心提取樣品在電鏡下不易找到病毒粒體,而墊層差速離心提取樣品在電鏡下就很容易找到PLRV特異性的粒體。二、紫外吸收曲線通過SephadexG-200柱層析取得了較純的病毒制劑。純化病毒260/280,260/240的比值分別高達(dá)1.59和1.35,病毒核蛋白的紫外吸收曲線也充分顯示出來。對純化的病毒制劑進(jìn)行電鏡觀察,其結(jié)果如圖1。任何一個視野中都可看到成片分布的病毒粒體。和其相比,差速離心的提取物在電鏡下所顯示的結(jié)果相差甚遠(yuǎn)。通過SephadexG-200柱層析得到的純化病毒為1.43mg/kg病組織。三、病毒的吸收曲線對差速離心之后得到的病毒提取物進(jìn)行蔗糖密度梯度離心分離,于254nm處檢測。其吸收曲線如圖3。得到的純化病毒為0.90mg/kg病組織。純化病毒OD260/280,260/240的比值分別達(dá)到1.77和1.43。對純化的病毒制劑進(jìn)行電鏡觀察,電鏡下每一個銅網(wǎng)網(wǎng)眼的所有區(qū)域中,排列著高度聚集的病毒粒體(圖2)。四、液氮冷凍研磨法提取plusv通過液氮冷凍研磨法提取PLRV,從每公斤病組織中提取到了1.16mgPLRV,而不采用液氮冷凍研磨法提取PLRV,所得的病毒量只是液氮冷凍研磨法的76%。五、蔗糖墊層差速離心后病毒的分離為了研究一步提取法對病毒收量的影響,和常規(guī)提取法做對比。試驗(yàn)結(jié)果表明平行的一組提純實(shí)驗(yàn)在進(jìn)一步經(jīng)過二次蔗糖墊層差速離心之后,常規(guī)提取法病毒的粗提量只為4.52mg/kg病組織,而一步提取法的病毒粗提量為5.93mg/kg病組織。按照上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果推算,墊層差速離心之后,4.47mg粗提病毒經(jīng)蔗糖密度梯度離心得到0.90mg純化病毒,則5.93mg的粗提量經(jīng)蔗糖密度梯度離心純化就能得到1.18mg純化的PLRV。六、抗血清效率測定在瓊脂雙擴(kuò)散和對流免疫電泳中,提純的PLRV與PLRV抗血清起反應(yīng),并形成單一的沉淀線,和正常植物蛋白抗血清不發(fā)生反應(yīng)。這些結(jié)果證明所制備的病毒提取物是特異性的,高純度的。七、馬鈴薯頂部葉片卷葉病指示植物經(jīng)飼毒蚜蟲傳毒及溫室培養(yǎng)20天后,洋酸漿上顯示出退綠,生長受阻,馬鈴薯上顯示出頂部葉片卷葉病癥。前者的傳毒率為80%,后者的傳毒率為100%。這些結(jié)果證明我們提純的PLRV具有良好的侵染活性。分子篩柱層析分離法長期以來PLRV的提純一直是一個比較困難的問題。這不僅是由于病毒在寄主植物體內(nèi)含量低,而且這種病毒局限于植物的韌皮部細(xì)胞內(nèi),以致在提純時難以從大量植物組織中提取極微量的病毒。我們在前人提純方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn),采用了一系列新的措施,取得了比較滿意的結(jié)果。這些措施在病毒的提取過程中各具有獨(dú)特的作用。墊層差速離心首次用于純化植物病毒的是Brakke和Roclhow。我們采用20%蔗糖墊層做差速離心來純化PLRV,不僅能去掉懸浮于病毒液中的游離核酸及一部分小于病毒的植物蛋白,而且更重要的是通過墊層可使相當(dāng)一部份小于病毒的植物蛋白懸浮于20%蔗糖液中被清除掉。將SephadexG-200柱層析應(yīng)用到PLRV的純化上,能得到純度較高的病毒。這種純化程序經(jīng)濟(jì)、簡便、快速,對于缺乏密度梯度離心條件的工作者來說是可取的。如果將第一次柱層析得到的病毒液再重復(fù)一次或兩次層析分離,可進(jìn)一步得到純化。與二次差速離心以及墊層差速離心分離方法相比較,分子篩柱層析分離法是一種非常有效的純化病毒方法。由于黃化病毒組的病毒在寄主植物體內(nèi)寄生的部位不同于其它病毒組,因而一般勻漿方法難以將病毒充份提取出來。我們將液氮冷凍方法用于提取PLRV,液氮破碎植物組織細(xì)胞,特別是破碎韌皮部細(xì)胞,能起著使病毒充分釋放的效果,是提高病毒產(chǎn)額的有效措施。以往學(xué)者在提取PLRV時,首先以緩沖液勻漿植物組織,而后榨汁。得到汁液后再用有機(jī)溶劑變性植物蛋白。本實(shí)驗(yàn)采用一步提取法,即是將植物組織、提取緩沖液、植物蛋白變性劑等混合在一起進(jìn)行勻漿,所獲得的病毒量比常規(guī)提取者多。其原因可能是:1.由于破碎的植物組織細(xì)胞所釋放的各種降解病毒粒體的酶類物質(zhì)立刻受到有機(jī)溶劑的作用而失活;2.是在常規(guī)提取法勻漿物中,有一部分組織細(xì)胞壁未被破碎,在有機(jī)溶劑變性過程中,完整的細(xì)胞隨其它雜蛋白一起被沉淀除去,降低了病毒的產(chǎn)量;3.這種方法縮短了提取病毒的周期,可以提高病毒的活性。許多學(xué)者從感病植物組織中提取PLRV,其病毒收量都少于lmg/kg。我們采用了上述新的提純方法,從酸漿中提取PLRV,產(chǎn)量高達(dá)1.