玻璃化冷凍對(duì)牛卵母細(xì)胞發(fā)育的影響

玻璃化冷凍對(duì)牛卵母細(xì)胞發(fā)育的影響

冷杉保存嬰兒的細(xì)胞對(duì)生物材料的發(fā)展、生物資源的保護(hù)和利用以及人類輔助生殖技術(shù)的研究具有重要意義。但是冷凍后的卵母細(xì)胞會(huì)發(fā)生透明帶蛋白變性,同時(shí)透明帶上ZP3受體減少,使得精子穿越透明帶過(guò)程受到抑制,導(dǎo)致冷凍解凍后卵母細(xì)胞體外受精率下降。卵母細(xì)胞胞漿內(nèi)單精子注射技術(shù)(ICSI)借助顯微操作將精子或精細(xì)胞注入卵母細(xì)胞質(zhì),無(wú)透明帶和卵黃質(zhì)對(duì)精子入卵的阻礙,且對(duì)精子的活力及完整性沒有嚴(yán)格要求,只需要精子的基因組是完整的就可以進(jìn)行操作。將ICSI技術(shù)應(yīng)用于冷凍保存卵母細(xì)胞,可以更有效的保護(hù)瀕危物種,充分利用豬、牛、羊等大家畜的遺傳和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。但是冷凍會(huì)造成卵母細(xì)胞骨架及超微結(jié)構(gòu)的損傷,通過(guò)影響卵母細(xì)胞的質(zhì)量,進(jìn)而影響ICSI后胚胎的發(fā)育潛力。目前,應(yīng)用ICSI技術(shù)對(duì)冷凍保存的卵母細(xì)胞進(jìn)行受精,在人和小鼠上分別獲得了46%和16.5%的受精率。牛卵母細(xì)胞玻璃化冷凍后經(jīng)ICSI獲得胚胎發(fā)育的報(bào)道甚少。不同成熟階段牛卵母細(xì)胞對(duì)冷凍的耐受性存在差異,解凍后體外受精能力也有差異。但關(guān)于玻璃化冷凍不同成熟階段牛卵母細(xì)胞經(jīng)ICSI后胚胎發(fā)育的研究尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)對(duì)成熟培養(yǎng)16h(MⅠ期)及23h(MⅡ期)的牛卵母細(xì)胞玻璃化冷凍后進(jìn)行單精子注射研究,旨在摸索適于冷凍后進(jìn)行ICSI的牛卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)階段,進(jìn)而提高冷凍卵母細(xì)胞ICSI的效率。1材料和方法1.1培養(yǎng)箱、拉針箱、煅針儀倒置顯微鏡和熒光顯微鏡(Nikon,日本),CO2培養(yǎng)箱(FormaScientificInc,美國(guó)),拉針儀(SUTTERINSTRUMENTCO,美國(guó)),煅針儀(Narishige,日本)。1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物牛卵巢來(lái)自河北省廊坊市大廠回族自治縣的某屠宰場(chǎng)。1.3卵丘-卵母細(xì)胞體cos的制備和培養(yǎng)從屠宰廠收集成年黃牛的卵巢,保存在30～35℃生理鹽水中4h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。用37℃生理鹽水洗滌3次,以帶有19G針頭的10mL注射器抽取卵巢表面2～8mm卵泡中的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs),挑選完整致密的COCs,用PBS溶液和成熟液分別洗滌2次,移入含M199成熟培養(yǎng)液的四孔板,置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(培養(yǎng)條件為38.5℃,100%濕度,5%CO2)。1.4大樹人工卵母細(xì)胞的培養(yǎng)與解凍用自制小酒精燈,明火將0.25mL(France)塑料細(xì)管加熱變軟后拉成OPS管。OPS管壁外徑為(0.23±0.01)mm,管壁厚0.08mm。在空氣中冷卻后用手術(shù)刀片在其細(xì)端切開,細(xì)端長(zhǎng)度(2.5±0.5)cm。試驗(yàn)在38.5℃恒溫臺(tái)上操作,使試驗(yàn)用具及試劑得到充分平衡,室溫為(25±1)℃。成熟培養(yǎng)16h或23h的卵母細(xì)胞,機(jī)械吹打使得卵母細(xì)胞周圍留有2～3層卵丘細(xì)胞。將卵母細(xì)胞移入10%EG+10%DMSO溶液中平衡30s,然后移入玻璃化溶液EDFS30中平衡25s,最后卵母細(xì)胞被吸入OPS中直接投入液氮冷凍保存。每支管裝5～6枚卵母細(xì)胞。解凍時(shí)將裝有卵母細(xì)胞的OPS從液氮中取出后,立即將含有卵母細(xì)胞的細(xì)管部分浸入38.5℃的0.25mol/L蔗糖解凍液中,將卵母細(xì)胞從OPS中吹出并在此液中平衡3min,然后移入0.15mol/L蔗糖解凍液中平衡2min;用成熟培養(yǎng)液洗滌2次,形態(tài)正常者(根據(jù)細(xì)胞光澤度和膜完整性)判定為存活,移入成熟培養(yǎng)液中待用,并設(shè)新鮮卵母細(xì)胞為對(duì)照組。1.5離心-吹打、冷凍細(xì)管冷凍精液在38.5℃水浴中解凍30s,用滅菌濾紙吸取細(xì)管外壁水分。剪去細(xì)管兩頭,將精液滴入裝有3mLBO洗精液的15mL離心管中,用移液器輕輕吹打混勻,置入離心機(jī)中離心8min(1800r/min),去除上清液重復(fù)洗滌1次,加入1mLBO液輕輕吹打混勻。40μL分裝后-20℃冷凍保存?zhèn)溆谩＝鈨鰰r(shí)直接水浴融解即可。1.6裸卵的制備冷凍保存的成熟培養(yǎng)16h和23h卵母細(xì)胞,解凍后分別繼續(xù)培養(yǎng)8h和1h(總培養(yǎng)時(shí)間為24h)。解凍的以及未經(jīng)冷凍的新鮮卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)至24h后,用移液器輕輕吹打卵丘細(xì)胞,使成裸卵。選擇形態(tài)完整、胞質(zhì)均勻并排出第一極體的卵母細(xì)胞準(zhǔn)備單精子注射實(shí)驗(yàn)用。1.7卵母細(xì)胞和精子注射用Φ60mm培養(yǎng)皿的上蓋制作4個(gè)60μL的液滴,依次為1∶1(V∶V)的精子稀釋液和10%PVP,10%PVP液洗滴,與2個(gè)PBS操作滴。液滴上覆石蠟油。卵母細(xì)胞固定針內(nèi)徑為10～15μm,精子注射針內(nèi)徑8～10μm。注射針在PVP精子液滴中吸入1個(gè)精子后移入操作液滴,用固定針固定卵母細(xì)胞,使極體處于時(shí)針的06:00(或12:00)的位置,注射針從時(shí)針的15:00位置進(jìn)針,穿過(guò)卵質(zhì)膜刺入卵胞質(zhì)中,回吸少量胞質(zhì),再將精子連同微量操作液注入卵胞質(zhì),然后輕輕撤出注射針,并將卵母細(xì)胞從固定針釋放。1.8注射母細(xì)胞后激活注射后的卵母細(xì)胞先經(jīng)7%的乙醇激活5min后移入6-DMAP中激活4h,隨后將受精卵轉(zhuǎn)入早期胚胎培養(yǎng)液中培養(yǎng)。1.9細(xì)胞培養(yǎng)胚胎激活后移入培養(yǎng)液CR1aa+3mg/mL牛血清白蛋白(BSA)中在38.5℃、5%CO2和100%濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng),48h觀察卵裂并移入CR1aa+5%FBS中培養(yǎng)7～8d,記錄囊胚數(shù),統(tǒng)計(jì)囊胚發(fā)育率。1.10囊壁細(xì)胞計(jì)數(shù)囊胚細(xì)胞計(jì)數(shù)采用10μg/mL的Hoechst33342染色壓片,在UV激發(fā)光下采集圖像并記錄囊胚細(xì)胞數(shù)。1.11統(tǒng)計(jì)分析顯著性分析的數(shù)據(jù)均用One-wayANOVA中的LSD檢驗(yàn),P<0.05視為2個(gè)數(shù)據(jù)差異顯著,所有數(shù)據(jù)結(jié)果用平均值±SE表示。2結(jié)果2.1月生物被孤成蟲激活后的產(chǎn)卵及囊胚發(fā)育率由表1可知,成熟培養(yǎng)至24h新鮮的牛卵母細(xì)胞經(jīng)過(guò)ICSI注射過(guò)程(空注),其孤雌激活后的卵裂率(84.90%)、囊胚發(fā)育率(43.39%)以及囊胚細(xì)胞數(shù)(83)與不注射的對(duì)照組(77.23%,41.58%,76)相比無(wú)顯著性差異(P>0.05)。2.2冷凍組與成熟組形態(tài)正常率比較由表2可知,成熟培養(yǎng)23h的卵母細(xì)胞冷凍解凍后的形態(tài)正常率(87.33%)顯著高于成熟16h(76.66%)(P<0.05),并且冷凍組的形態(tài)正常率都顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。2.3sda檢測(cè)卵母細(xì)胞中囊胚發(fā)育由表3可知,選擇成熟培養(yǎng)16h和23h牛卵母細(xì)胞,冷凍解凍后分別繼續(xù)培養(yǎng)到24h,ICSI并經(jīng)激活后的卵裂率(69.71%、72.49%)與成熟24h新鮮卵母細(xì)胞對(duì)照組(83.73%)間無(wú)顯著性差異(P>0.05);而囊胚發(fā)育率(5.29%、14.41%)均顯著低于對(duì)照組(24.40%)(P<0.05)。另外,成熟培養(yǎng)23h的卵母細(xì)胞冷凍解凍后經(jīng)ICSI獲得的囊胚發(fā)育率(14.41%)顯著高于16h卵母細(xì)胞(5.29%)(P<0.05)。3討論3.1機(jī)械操作過(guò)程對(duì)牛卵母細(xì)胞發(fā)育的影響有研究認(rèn)為顯微注射的操作過(guò)程會(huì)影響胚胎早期至囊胚的發(fā)育,而Keskintepe等的研究證實(shí)空注與孤雌激活的牛卵母細(xì)胞囊胚發(fā)育率無(wú)顯著性差異。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)成熟24h牛卵母細(xì)胞實(shí)施空注及孤雌激活對(duì)比實(shí)驗(yàn)表明,ICSI本身機(jī)械操作過(guò)程不會(huì)影響后期胚胎的卵裂率、囊胚發(fā)育率及囊胚細(xì)胞數(shù),與Keskintepe等的研究結(jié)果相似。這可能是由于注射過(guò)程中注射針抽吸胞漿,造成對(duì)卵母細(xì)胞的機(jī)械刺激,充分引發(fā)Ca2+釋放以及Ca2+附加峰,可以較好的激活卵母細(xì)胞,彌補(bǔ)了注射過(guò)程對(duì)卵母細(xì)胞造成的機(jī)械損傷的影響。3.2冷凍對(duì)石墨原螯蝦支皮細(xì)胞的影響Mavrides等玻璃化冷凍體外成熟培養(yǎng)至MⅡ期的牛卵母細(xì)胞,解凍后進(jìn)行ICSI,獲得的卵裂率與新鮮對(duì)照組無(wú)顯著性差異。但是Rho等玻璃化冷凍保存MⅡ期的牛卵母細(xì)胞,解凍后ICSI胚胎的卵裂率、囊胚發(fā)育率及囊胚細(xì)胞數(shù)均低于新鮮對(duì)照組。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明,冷凍顯著降低了卵母細(xì)胞的形態(tài)正常率,且對(duì)其進(jìn)行ICSI得到的囊胚率也顯著低于未冷凍的對(duì)照組。導(dǎo)致冷凍卵母細(xì)胞ICSI胚胎發(fā)育能力下降的原因可能是在玻璃化冷凍過(guò)程中,溫度和滲透壓的劇烈改變以及冷凍保護(hù)劑的毒性等將導(dǎo)致細(xì)胞骨架及超微結(jié)構(gòu)不同程度的損傷。Abe等證實(shí)紡錘體在降溫過(guò)程中極易解聚,導(dǎo)致隨后的減數(shù)分裂異常,染色體異常率增高,囊胚發(fā)育率下降。所以冷凍保存卵母細(xì)胞會(huì)影響其ICSI后胚胎的發(fā)育能力。3.3不同成熟培養(yǎng)階段的牛卵母細(xì)胞解凍保存對(duì)引物外受精性的影響有實(shí)驗(yàn)證實(shí)不同的成熟階段會(huì)影響卵母細(xì)胞玻璃化冷凍保存后的發(fā)育。Hochi等冷凍牛不同發(fā)育階段卵母細(xì)胞,包括GV、GVBD、MⅠ期及MⅡ期,結(jié)果發(fā)現(xiàn)卵母細(xì)胞處于MⅠ期較其他發(fā)育階段具有更高的受精率。而Lim等采用程序冷凍法分別對(duì)體外成熟培養(yǎng)0、6、12、18、24h的牛卵母細(xì)胞冷凍保存,解凍后分別培養(yǎng)至24h進(jìn)行體外受精,證明MⅡ期卵母細(xì)胞解凍后卵裂率顯著高于MⅠ期。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了成熟培養(yǎng)到MⅡ期的卵母細(xì)胞比MⅠ期的更適合于玻璃化冷凍保存,其解凍后ICSI囊胚發(fā)育率更高。分析其原因可能是冷凍未成熟卵母細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致卵丘