白藜蘆醇通過拮抗hpxr對(duì)利福平誘導(dǎo)的mdr1、蛋白表達(dá)及活性的影響

白藜蘆醇通過拮抗hpxr對(duì)利福平誘導(dǎo)的mdr1、蛋白表達(dá)及活性的影響

懷孕醇x受體（pxr）也被稱為醇醇x受體（sxr），是一個(gè)高度激活的遺傳因素。下一種影響因素的基因包括異源性藥物或養(yǎng)分的代謝功能，包括cyp450酶系c-接口-代謝酶、葡萄糖乙酸鈉（urt）代謝酶和磷糖蛋白[p-gdp），以及由cyp450酶系c產(chǎn)生的-代謝酶、葡萄糖乙酸鈉（urt）和-糖蛋白[p-rp）。編碼基因?yàn)閙dr1（現(xiàn)簡(jiǎn)稱abcb1）、多藥物耐心相關(guān)蛋白（mrp2、mr3、mrp4、mr5）和乳腺癌相關(guān)蛋白（bcrp）-藥物轉(zhuǎn)移瘤，它對(duì)藥物或靶物質(zhì)的吸收、分布、代謝和排泄等過程有重要影響。當(dāng)配體結(jié)合和活化PXR后,PXR與DNA反應(yīng)元件RXR結(jié)合成異源二聚體,形成的異源二聚體結(jié)合靶基因的PXR反應(yīng)元件,增加其靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。目前多數(shù)抗腫瘤藥物需經(jīng)PXR靶酶/蛋白的處置方能自體內(nèi)滅活清除,因此PXR的轉(zhuǎn)錄活化可使化療藥物自身或使合用的其他化療藥對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性或療效降低。然而,這種配體活化作用可以被PXR拮抗劑所拮抗,例如,抑制PXR配體對(duì)下游靶基因MDR1的誘導(dǎo)表達(dá),可逆轉(zhuǎn)MDR1介導(dǎo)的多藥耐藥作用,因而PXR成為逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的新靶點(diǎn)。目前已經(jīng)報(bào)道的PXR拮抗劑包括抗腫瘤藥物ET-743、酮康唑等唑類抗真菌藥物、植物雌激素香豆雌酚等。白藜蘆醇(resveratrol,RES),化學(xué)名稱為3,5,4′-三羥基反苯二烯(3,4′,5,-trihydroxystilbene),屬于非黃酮類多酚化合物,分布較為廣泛,目前已在葡萄、藜蘆、虎杖、花生等70多種植物中發(fā)現(xiàn)。1997年,Jang等在Science雜志上報(bào)道了白藜蘆醇對(duì)癌癥的始發(fā)、促進(jìn)及發(fā)展階段表現(xiàn)出的抑制作用,從而使白藜蘆醇成為癌癥化學(xué)預(yù)防和化學(xué)治療領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)。隨著對(duì)白藜蘆醇抗腫瘤活性研究的不斷發(fā)展和深入,已發(fā)現(xiàn)它對(duì)肝細(xì)胞癌、乳腺癌、前列腺癌、胃腺癌、口腔鱗癌、白血病、卵巢癌、黑色素瘤等多種腫瘤細(xì)胞均有明顯抑制作用。此外,Al-Abd等發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇還可以提高腫瘤細(xì)胞對(duì)抗癌藥物(如紫杉醇)的敏感性,該作用主要與其可以降低多藥耐藥蛋白P-gp的表達(dá)相關(guān)。因此,本研究旨在探討白藜蘆醇能否通過PXR通路對(duì)P-gp基因、蛋白表達(dá)及活性產(chǎn)生影響。1材料和方法1.1材料表面1.1.1試劑和培養(yǎng)基LS174T(人結(jié)腸癌細(xì)胞)細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心,由本實(shí)驗(yàn)室保存;pSG5-hPXR表達(dá)質(zhì)粒由美國(guó)德克薩斯州大學(xué)StevenKliewer教授惠贈(zèng);tk-MDR1-Luc報(bào)告基因質(zhì)粒由美國(guó)匹茲堡大學(xué)謝文教授惠贈(zèng);pRL-tk內(nèi)參質(zhì)粒購(gòu)自Promega公司;雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司;培養(yǎng)基RPMI1640、胎牛血清和胰酶購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司;Lipofectamine2000和OPTI-MEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;利福平(rifampicin,RIF),DMSO(dimethylsulfoxide)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;白藜蘆醇(批號(hào):111535-200502)和酮康唑(批號(hào):100294-200602)購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;TRIzol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒DRR047A及熒光染料SYBRGreen均購(gòu)自日本TaKaRa公司;P-gp抗體購(gòu)自美國(guó)SantaCruz公司;GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)CellSignalingTechnology公司。1.1.2儀器、檢測(cè)方法SW-CJ-2FD型超凈化工作臺(tái),蘇州蘇凈集團(tuán)安泰公司;BB16型二氧化碳培養(yǎng)箱,美國(guó)HERAEUS公司;XSZ-D2型顯微鏡,重慶光學(xué)儀器廠;LumatLB9507型管式發(fā)光檢測(cè)儀,德國(guó)Berthold公司;紫外分光核酸蛋白分析儀,美國(guó)BECKMAN公司;ThermoMultiskanMK3型酶標(biāo)儀,美國(guó)Thermo公司;2.0LightCycler定量PCR儀,羅氏公司;流式細(xì)胞儀,美國(guó)BECKMAN公司。1.2方法1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)1.2.2給藥和染色1.2.3報(bào)告中的基因活性測(cè)試1.2.4real-time1.2.5Western1.2.6羅丹明123rh123的積累實(shí)驗(yàn)1.2.7統(tǒng)計(jì)處理2結(jié)果2.1mdr1檢測(cè)雙熒光酶活性在瞬轉(zhuǎn)入pSG5-hPXR、tk-MDR1-Luc和pRL-TK質(zhì)粒的LS174T細(xì)胞給予RIF(10μmol·L-1)和RES24h后,檢測(cè)雙熒光素酶活性,所得各處理組細(xì)胞熒光素酶比活性結(jié)果見Fig1。RES在25和50μmol·L-1濃度組均可拮抗RIF誘導(dǎo)的MDR1報(bào)告基因活性,經(jīng)計(jì)算差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。且與KTZ相比,RES對(duì)PXR的拮抗作用高于KTZ。2.2hpxr細(xì)胞表達(dá)多態(tài)性檢測(cè)將pSG5-hPXR全長(zhǎng)表達(dá)質(zhì)粒用脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)入LS174T細(xì)胞5～6h后,更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h后檢測(cè)細(xì)胞中hPXR的表達(dá),Fig2顯示,在轉(zhuǎn)染了hPXR的細(xì)胞中,PXRmRNA是未轉(zhuǎn)染的32.2倍,PXR的蛋白水平也明顯升高,證明高表達(dá)hPXR的細(xì)胞模型建立成功。2.3res對(duì)rna誘導(dǎo)的表達(dá)在高表達(dá)hPXR的LS174T細(xì)胞中,白藜蘆醇對(duì)利福平誘導(dǎo)的MDR1mRNA表達(dá)的影響如Fig3,RIF可將MDR1mRNA誘導(dǎo)至對(duì)照組的1.8倍,同時(shí)給予RIF和RES(25和50μmol·L-1),50μmol·L-1的RES可將RIF的誘導(dǎo)倍數(shù)降至1.3倍,且均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),而在未轉(zhuǎn)染的正常LS174T細(xì)胞中無此拮抗作用。然而,在Fig4中,正常LS174T細(xì)胞和高表達(dá)hPXR的細(xì)胞中,RES在各濃度均可明顯降低RIF誘導(dǎo)的P-gp(MDR1)蛋白表達(dá)。2.4羅丹明133對(duì)利福平對(duì)小鼠胞內(nèi)羅丹明133的增殖影響由于利福平可以增加外排轉(zhuǎn)運(yùn)體P-gp的表達(dá)量,從而使P-gp底物羅丹明123在細(xì)胞內(nèi)的積累量降低。如Fig5所示,利福平組細(xì)胞內(nèi)羅丹明123積累量下降至對(duì)照組的77.7%,同時(shí)給予25和50μmol·L-1白藜蘆醇后,胞內(nèi)積累量分別上升至91.7%和95.1%,與利福平組比,差異均有顯著性(P<0.05)。該結(jié)果說明,白藜蘆醇可以通過降低利福平對(duì)P-gp的誘導(dǎo)而降低P-gp的轉(zhuǎn)運(yùn)活性。3白導(dǎo)體對(duì)p-gp表達(dá)的調(diào)控作用檢測(cè)腫瘤的多藥耐藥性(multidrugresistance,MDR)是導(dǎo)致臨床治療中化療的失敗,影響患者預(yù)后及生存的重要因素之一。這種多藥耐藥的產(chǎn)生主要由ATP結(jié)合盒(ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族的跨膜蛋白所引起,其中MDR1基因編碼的P-糖蛋白(P-gp)過表達(dá)是MDR產(chǎn)生的經(jīng)典機(jī)制。PXR作為一種配體活化的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,不僅在正常組織中表達(dá),如肝、腸、腦、腎及免疫細(xì)胞等,而且在乳腺癌、結(jié)腸癌、骨肉瘤、卵巢癌、前列腺癌等許多人類腫瘤中表達(dá)。而眾多的抗腫瘤藥物,如紫杉醇等,作為PXR的配體,均可激活PXR導(dǎo)致MDR1的表達(dá)升高而產(chǎn)生多藥耐藥現(xiàn)象,降低對(duì)腫瘤的化療效果。因此,尋找和發(fā)現(xiàn)新的PXR拮抗劑對(duì)抑制腫瘤治療中MDR的產(chǎn)生及逆轉(zhuǎn)MDR有重要作用。在研究PXR拮抗劑的作用機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn),抗真菌藥酮康唑及其同系物(氟康唑、伊曲康唑等)可對(duì)已經(jīng)與配體結(jié)合的PXR進(jìn)行變構(gòu)修飾,通過阻斷共活化因子SRC-1與AF-2區(qū)的結(jié)合位點(diǎn),產(chǎn)生PXR拮抗作用,進(jìn)而抑制其下游靶基因MDR1及CYP3A4的轉(zhuǎn)錄活化和表達(dá)。植物雌激素香豆雌酚作為PXR拮抗劑對(duì)PXR的抑制作用在配體結(jié)合袋以外,采用熒光偏振體外觀察香豆雌酚與PXR的AF-2位點(diǎn)結(jié)合,并可抑制利福平增加的PXR與SRC-1的相互作用。本研究旨在研究白藜蘆醇通過PXR通路對(duì)下游靶基因MDR1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用,在正常及hPXR高表達(dá)LS174T細(xì)胞中,檢測(cè)白藜蘆醇對(duì)利福平誘導(dǎo)的MDR1轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平的影響。雙熒光報(bào)告基因活性檢測(cè)結(jié)果表明,25和50μmol·L-1濃度的白藜蘆醇可以明顯下調(diào)利福平通過激活PXR對(duì)MDR1的誘導(dǎo)作用,該實(shí)驗(yàn)提示白藜蘆醇可以拮抗PXR的配體激活作用。在高表達(dá)hPXR的細(xì)胞中,給予利福平和白藜蘆醇共同孵育24h,檢測(cè)MDR1mRNA水平,發(fā)現(xiàn)50μmol·L-1白藜蘆醇可以將利福平誘導(dǎo)作用明顯降低,而在未轉(zhuǎn)染PXR的細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)此作用,證明白藜蘆醇通過拮抗PXR活性影響MDR1的轉(zhuǎn)錄過程。在蛋白水平,轉(zhuǎn)染PXR與否均可使MDR1調(diào)控的P-糖蛋白水平與利福平組相比明顯下降,推測(cè)兩種水平中結(jié)果的不一致可能因?yàn)榘邹继J醇還可以影響MDR1轉(zhuǎn)錄后修飾過程,從而影響P-gp蛋白的翻譯。在P-gp的活性實(shí)驗(yàn)中,利福平由于誘導(dǎo)P-gp表達(dá)而使Rh123外排,在胞內(nèi)的積累量降低,白藜蘆醇在25和50μmol·L-1濃度時(shí),可以將LS174T細(xì)胞中的Rh123積累量明顯升高(P<0.05),此結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)白藜蘆醇可以降低利福平對(duì)P-gp表達(dá)的誘導(dǎo)作用,從而影響P-gp的活性。整個(gè)實(shí)驗(yàn)中,均以經(jīng)典的PXR拮抗劑酮康唑作為陽性對(duì)照組,且白藜蘆醇所選取的濃度與10μmol·L-1利福平合用不影響細(xì)胞存活率。已有研究表明,反式白藜蘆醇單獨(dú)使用時(shí)是PXR的弱激動(dòng)劑,約為10μmol·L-1利福平的1.3%,本研究結(jié)果顯示白藜蘆醇與PXR強(qiáng)激動(dòng)劑利福平合用時(shí),可以拮抗利福平對(duì)PXR的激活作用,但白藜蘆醇拮抗PXR的機(jī)制是否與影響PXR與SRC-1相互作用有關(guān)還有待考察。MDR1的調(diào)控機(jī)制除了PXR外,還有CAR、NF-κB等核受體參與,因此還需進(jìn)一步研究白藜蘆醇是否也可以通過其它核受體調(diào)節(jié)MDR1的表達(dá)。綜上所述,本研究闡明了白藜蘆醇通過PXR通路對(duì)MDR1的影響,為其在逆轉(zhuǎn)腫瘤藥物多藥耐藥中的作用提供了數(shù)據(jù),也提示了因此而產(chǎn)生的潛在藥物相互作用的可能。LS174T細(xì)胞在含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清、雙抗(1×105U·L-1青霉素,100mg·L-1鏈霉素)的RPIM1640培養(yǎng)基,5%CO2,37℃常規(guī)培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)期細(xì)胞接種于96孔板或12孔板,每孔5×104或2×105個(gè)細(xì)胞,待細(xì)胞覆蓋率達(dá)80%后,用脂質(zhì)體(LipofeetaminTM2000)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入LS174T細(xì)胞中,質(zhì)粒和脂質(zhì)體用OPTI-MEM培養(yǎng)基稀釋。檢測(cè)報(bào)告基因活性時(shí),將75ngpSG5-hPXR、75ngtk-MDR1-Luc和作為內(nèi)參的pRL-TK質(zhì)粒15ng與0.5μlLipofectamineTM2000陽離子脂質(zhì)體孵育20min后加至96孔板的1個(gè)培養(yǎng)空孔;建立高表達(dá)hPXR細(xì)胞模型時(shí),每孔用2μl脂質(zhì)體將1.2μgpSG5-hPXR質(zhì)粒轉(zhuǎn)入12孔板細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后5～6h,更換含有藥物的培養(yǎng)基,0.1%DMSO為空白對(duì)照組,利福平(RIF)為誘導(dǎo)組,利福平+酮康唑(KTZ)為陽性拮抗組。各組藥物處理后,每孔加入25μl1×PassiveLysisBuffer(PLB),室溫下振蕩15～30min,將20μlLuciferaseAssaySubstrate溶液加入報(bào)告基因檢測(cè)試管中,后加入20μlPLB裂解液,檢測(cè)螢火蟲熒光素酶活性,再加入20μlStop&GloReagent,檢測(cè)海腎熒光素酶活性。每孔熒光素酶活性值用海腎熒光素酶活性進(jìn)行校正,即每孔熒光素酶活性值=螢火蟲熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值。0.1%DMSO作為對(duì)照組,其他處理組的熒光素酶活性與其相比,以倍數(shù)表示表達(dá)量的高低。PCR將給予藥物處理24h的細(xì)胞用PBS清洗兩遍后提取總RNA,并用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。使用的引物序列為:GAPDH上游引物:5′-GGATTTGGTCGTATTGGG-3′;GAPDH下游引物:5′-GGAAGATGGTGATGGGATT-3′;MDR1上游引物:5′-CCATAGCTCGTGCCCTTGTTAGA-3′;MDR1下游引物:5′-CGGTGAGCAATCACAATGCAG-3′;hPXR上游引物:5′-CCCAGCCTGCTCATAGGTTC-3′;下游引物:5′-CTGTGATGCCGAACAACTCC-3′。按下列條件在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增:94℃×1min→95℃×30s,58℃×30s,72℃×30s,共40個(gè)循環(huán)→95℃×10s→65℃×45s→40℃×60s。利用數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)每個(gè)樣品的熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行分析并自動(dòng)計(jì)算出Ct值,將各個(gè)樣品中MDR1的Ct值減去內(nèi)參對(duì)照GAPDH的Ct值得到各自的ΔCt值,然后計(jì)算各個(gè)處理劑量重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次的平均ΔCt值,再將處理組的平均ΔCt值減去對(duì)照組的平均ΔCt值,得到ΔΔCt值用于計(jì)算各相關(guān)基因表達(dá)的變化倍數(shù)。即以GAPDH為內(nèi)對(duì)照,藥物處理細(xì)胞后MDR1mRNA的表達(dá)水平相對(duì)于對(duì)照組的變化倍數(shù)為:2-ΔΔCt倍。blot將轉(zhuǎn)染hPXR及藥物處理后的LS174T細(xì)胞提取蛋白并采用BCA試劑盒定量,置-80℃保存。每次上樣前99℃變性10min,以25μg每孔的量加入8%SDS膠(碧云天試劑盒)中進(jìn)行電泳,電泳條件為75V,30min跑積層膠,換用120V電壓繼續(xù)電泳60min分離蛋白。將凝膠上的蛋白用250mA恒流電轉(zhuǎn)90min至PVDF膜上后用5%脫脂奶粉進(jìn)行封閉60～90min。封閉后的PVDF膜浸入按比例稀釋的一抗,(GAPDH一抗按1∶1000溶于一抗稀釋液,P-gp一抗按1∶200溶于一抗稀釋液),4℃過夜孵育。用TBST清洗3次后的PVDF膜置于二抗中室溫孵育60mi