日落黃和-胡蘿卜素與bsa相互作用的光譜學研究

日落黃和-胡蘿卜素與bsa相互作用的光譜學研究

日落下，通常用于食品和藥物的顏色。從長遠來看，過度添加過量的異氮色素會加重肝臟的解毒負荷，嚴重損害肝臟的功能。根據(jù)研究，長期使用人造藥物會影響兒童的智力，導致焦慮和其他行為障礙。它是自然界中普遍存在和穩(wěn)定的天然顏色。它的顏色和濃度隨濃度而不同，它可以覆蓋從紅到黃的所有顏色。因此，它被廣泛應用于食品行業(yè)。它是一種自然界普遍存在且相對穩(wěn)定的自然色素。這種本身的顏色和濃度隨濃度而不同，它可以覆蓋從紅到黃的所有顏色。因此，它被廣泛應用于食品行業(yè)。它適用于發(fā)展石油、食品產(chǎn)品和蛋白質(zhì)產(chǎn)品，如人造奶油、膠囊、魚漿果粉、素食品品和速食面的顏色。此外，它還起到了重要的作用，如日夜腐爛和日落下的黃色和柳樹的分子形狀（scheme1）。隨著社會的發(fā)展和生活質(zhì)量的提高，人們懷疑合成色素是否對健康產(chǎn)生了危害。在日常生活中，人們需要添加天然食用色素，但會逐漸減少含有合成色素的食物。牛血清白蛋白(BSA)是生命體血漿中含量最豐富的蛋白質(zhì),具有貯藏內(nèi)源代謝產(chǎn)物和外源藥物小分子等重要生理功能.有關(guān)小分子與牛血清白蛋白相互作用的研究十分活躍,目前這方面研究主要集中在藥物及一些有機小分子污染物與牛血清白蛋白的相互作用,而食品添加劑特別是食用色素與之相互作用的研究較少.本文在模擬人體生理pH條件下,采用熒光光譜法、紫外吸收光譜法、紅外光譜法和圓二色譜法研究日落黃和β-胡蘿卜素與BSA的相互作用,獲得它們與BSA結(jié)合過程的結(jié)合常數(shù)和熱力學常數(shù)等基本信息以及對BSA構(gòu)象的影響,并比較兩者與BSA相互作用過程的差異性.1實驗部分1.1實驗儀器和溶液PELS-55熒光分光光度計(美國,帶恒溫槽裝置),配有1.0cm熒光比色皿;Agilent8453紫外-可見分光光度計(美國)配有1.0cm比色皿;Thermo-Nicolet380傅立葉紅外(FT-IR)光譜儀(美國);MOS-450AF-CD圓二色光譜儀(法國).BSA(合肥博美生物科技有限公司,純度99%,分子量68000)用二次水配制成1.28×10-3和5.0×10-5mol/L儲備液,于1~4℃冰箱中保存.β-胡蘿卜素(美國Sigma公司)用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)配制成8.0×10-5mol/L標準使用液(由于β-胡蘿卜素對光和熱敏感,溶液都是現(xiàn)配現(xiàn)用).日落黃用二次水配制成4.0×10-3mol/L儲備液.緩沖液為Tris-HCl溶液(pH=7.40):先配制0.2mol/L的Tris溶液,準確稱取2.422g三羥基甲基氨基甲烷(上海藍季科技發(fā)展公司),溶于二次水中后,再移入100mL的容量瓶中并定容,取出25mL于100mL的容量瓶中,再加入45mL0.1mol/L的鹽酸溶液,用二次水定容.實驗中所用水均為二次蒸餾水.1.2實驗方法1.2.1日落黃和-胡蘿卜素熒光光譜的測定固定激發(fā)波長為280nm,入射和發(fā)射狹縫寬均為10nm,掃描速度為1200nm/min,記錄250~600nm的熒光光譜.實驗1:在pH=7的Tris-HCl緩沖溶液中,固定BSA的濃度(1.0×10-7mol/L),然后加入不同濃度的日落黃或β-胡蘿卜素(0~1.28×10-6mol/L,每次間隔8.0×10-8mol/L),混合均勻后靜置5min,至反應平衡,掃描其熒光光譜.實驗2:固定BSA的濃度為1.0×10-7mol/L,然后加入不同濃度的日落黃(0~1.28×10-6mol/L,每次間隔1.6×10-7mol/L)或β-胡蘿卜素(0~3.2×10-7mol/L,每次間隔4.0×10-8mol/L),混合均勻,放置5min,在溫度298,303和308K下測其熒光光譜.1.2.2測定200400nm的吸收光譜在pH=7的Tris-HCl緩沖溶液中,固定BSA的濃度(5.13×10-6mol/L),不斷加入日落黃(0~3.46×10-5mol/L,每次間隔2.67×10-6mol/L)或β-胡蘿卜素(0~1.74×10-5mol/L,每次間隔1.33×10-6mol/L),記錄200~900nm的吸收光譜.1.2.3紅外光譜和圓二色譜分析分別采集BSA(1.01×10-3mol/L)溶液和混合液(藥物和BSA濃度比為1∶1,4∶1,8∶1,12∶1和16∶1)的紅外光譜,掃描范圍為2000~1000cm-1,掃描次數(shù)為32次,取其平均值.在pH=7的Tris-HCl緩沖溶液中,固定BSA的濃度(1.67×10-7mol/L),分步加入日落黃溶液(使[SY]∶[BSA]=0,1,2,4,8,16和32).在恒定充氮的條件下,記錄190~280nm范圍內(nèi)的圓二色光譜,掃描速度為1nm/s.2結(jié)果與討論2.1bsa的動態(tài)猝滅事件蛋白質(zhì)中由于色氨酸和酪氨酸的存在使其具有內(nèi)源熒光(牛血清白蛋白激發(fā)波長280nm,發(fā)射波長為350nm).圖1為日落黃和β-胡蘿卜素與BSA相互作用的熒光光譜圖,從圖中可看出,在固定BSA濃度條件下,隨著日落黃或β-胡蘿卜素濃度的增加,BSA的熒光強度因被猝滅逐漸減弱,這就表明兩者都能跟BSA結(jié)合.熒光猝滅分為動態(tài)猝滅、靜態(tài)猝滅和非輻射能量轉(zhuǎn)移猝滅等幾類.動態(tài)猝滅由猝滅劑和熒光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子之間的碰撞引起,而靜態(tài)猝滅由猝滅劑與熒光物質(zhì)形成了不發(fā)光的配合物引起.動態(tài)猝滅過程可由Stern-Volmer方程來描述:式中F0和F分別為未加入和加入化合物時BSA的熒光強度,KSV為動態(tài)猝滅常數(shù),Kq為動態(tài)猝滅速率常數(shù),[Q]為猝滅劑的濃度,τ0為猝滅劑不存在時熒光分子的熒光壽命,對于生物大分子,τ0=10-8s.假設猝滅是由動態(tài)猝滅引起的,以式(1)中F0/F對[Q]作圖,得一直線,斜率就是KSV.本實驗考察了日落黃和β-胡蘿卜素在298,303和308K三個溫度下,對BSA的猝滅情況,所得的F0/F-[Q]曲線如圖2所示.結(jié)果表明(表1):隨著溫度的升高,兩種物質(zhì)對BSA的Stern-Volmer曲線的斜率都有所降低,KSV減小,且對BSA猝滅過程的Kq都遠大于2×1010L/(mol·s)(各類猝滅劑對熒光分子的最大擴散碰撞猝滅常數(shù)).由此,可推斷日落黃和β-胡蘿卜素對BSA的熒光猝滅作用不是由于動態(tài)碰撞所引起,而是由于形成了復合物而引起的靜態(tài)猝滅.2.2bsa和a-/a--內(nèi)酰胺衍生物的收峰與日落黃的分子鏈上c/o的分子鏈上c/o的分子鏈上c-#的耦合產(chǎn)物2.我們采用紫外吸收光譜法進一步研究了日落黃和β-胡蘿卜素與BSA的相互作用.固定BSA,不斷加入日落黃和β-胡蘿卜素的紫外吸收曲線,如圖3所示.由測定結(jié)果可知,BSA有兩個紫外吸收峰,分別在220和278nm處,其中278nm處的吸收峰是BSA分子中的色氨酸和酪氨酸中芳雜環(huán)的π-π*和n-π*躍遷引起的,而220nm處的吸收峰則主要是由肽鍵上C=O的n-π*躍遷引起的,與BSA的α-螺旋含量有關(guān).日落黃和β-胡蘿卜素濃度的不斷增大不但使得兩者自身的吸收峰不斷顯現(xiàn),且都使得BSA在278nm處的吸收強度不斷增加,說明這兩種物質(zhì)與BSA發(fā)生了作用,誘導BSA的分子鏈發(fā)生了類似降低pH值所出現(xiàn)的蛋白質(zhì)肽鍵伸展現(xiàn)象以致本來被包含在BSA內(nèi)部的色氨酸和酪氨酸殘基的芳雜環(huán)基團裸露出來,使吸收強度增加.2.3靜態(tài)模式的比較在靜態(tài)猝滅中,結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)可以通過雙對數(shù)公式求出.設生物大分子有n個相同且獨立的結(jié)合位置,可以通過公式推導得到以lg[(F0-F)/F]對lg[Q]作圖,由斜率和截距可求出藥物分子與蛋白質(zhì)分子作用的結(jié)合常數(shù)Ka和結(jié)合位點數(shù)n,所得結(jié)果列于表1中.數(shù)據(jù)表明,兩種物質(zhì)在BSA分子上只有一個結(jié)合位點.并且隨著溫度的升高,結(jié)合常數(shù)Ka減小,進一步驗證了靜態(tài)猝滅的機理.同時,我們還可以發(fā)現(xiàn),日落黃和β-胡蘿卜素與BSA都有很強的結(jié)合能力.β-胡蘿卜素是自然界中維生素A的前體,它進入體內(nèi)可以轉(zhuǎn)變?yōu)榫S生素A.正常情況下,β-胡蘿卜素在體內(nèi)游離的濃度非常小,大部分是以與BSA結(jié)合的形式儲存起來,只有當需要時,人體才會將β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)換成維生素A.因而,β-胡蘿卜素是維生素A的一個安全來源,不會因為攝食過量而造成維生素A累積中毒現(xiàn)象.而日落黃則有可能在體內(nèi)有一定的蓄積,長期過量食用可能對腎臟和肝臟產(chǎn)生一定的傷害.2.4日落黃與bsa的作用力藥物等有機小分子與蛋白質(zhì)等生物大分子常借助于靜電作用力、氫鍵作用力、范德華力和疏水作用力等相互結(jié)合形成超分子復合物.不同小分子與蛋白質(zhì)結(jié)合的作用力類型也不同.Ross等根據(jù)大量的實驗結(jié)果總結(jié)出判斷生物大分子與小分子結(jié)合性質(zhì)的熱力學規(guī)律,即ΔS>0可能是疏水和靜電作用力;ΔS<0可能為氫鍵和范德華力;ΔH>0,ΔS>0為典型的疏水作用力;ΔH<0,ΔS<0為氫鍵和范德華力;ΔH≈0或較小,ΔS>0為靜電作用力;ΔH<0是靜電作用力為主要作用力.當溫度變化不大的情況下可以把反應的焓變ΔH近似看作一個常數(shù),根據(jù)熱力學公式:式中R為常數(shù)[8.314J/(mol·K)].由式(3)和(4)可得日落黃和β-胡蘿卜素與BSA在不同溫度下反應的自由能ΔG、焓變ΔH和熵變ΔS,結(jié)果列于表1中.由表中數(shù)據(jù)判斷,在日落黃-BSA體系中,反應的ΔH為負,ΔS為正,可知日落黃與BSA之間的作用力主要為靜電引力;而在β-胡蘿卜素與BSA作用的過程中的ΔH和ΔS均為負值,表明,氫鍵和范德華力為主要驅(qū)動力.同時,兩個反應中的負的ΔG和ΔH表明,總個反應過程為自發(fā)進行的.2.5就結(jié)構(gòu)研究2.5.1日落黃與-胡蘿卜素相互作用的紅外光譜表征維持蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的作用力有多種,其中最重要的是氫鍵,不同二級結(jié)構(gòu)的氫鍵強度不同,FT-IR譜的酰胺Ι帶(1600~1700cm-1)和酰胺ΙΙ帶(1500~1600cm-1)對羰基的幾何振動和氫鍵結(jié)構(gòu)非常敏感,且酰胺Ι帶相對酰胺ΙΙ帶對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化更為敏感.當?shù)鞍踪|(zhì)所處的環(huán)境發(fā)生變化時,其特征紅外吸收光譜的吸收強度和譜帶位置會發(fā)生變化.實驗所得的BSA以及日落黃或β-胡蘿卜素存在下BSA的紅外光譜圖如圖4所示.圖4A是不同濃度的日落黃與BSA相互作用的紅外光譜圖,圖4B為相同條件下β-胡蘿卜素與BSA相互作用的紅外光譜圖,從圖中可知,兩物質(zhì)基本都不影響B(tài)SA酰胺ΙΙ帶的峰位置,在BSA酰胺Ι帶的峰位處,日落黃使其峰位置由1662cm-1移至1649cm-1,有13cm-1的變化.而β-胡蘿卜素基本不對其峰位置產(chǎn)生影響(圖4B中最后一根譜線相對來說有微小偏移,這可能是由于我們所使用的紅外光譜儀的分辨率為4cm-1,而引起的一定的誤差).對比兩圖可發(fā)現(xiàn),日落黃可能會引起B(yǎng)SA構(gòu)象的變化,而β-胡蘿卜素對其構(gòu)象基本不產(chǎn)生影響.譜圖中,吸收峰強度的不斷減小是由于藥物濃度不斷增大而帶來的體積效應使得BSA的相對濃度不斷減小引起的.2.5.2日落黃在bsa中-螺旋的含量變化為進一步考察日落黃對BSA構(gòu)象的改變,我們采用圓二色譜法研究了日落黃與BSA相互作用,如圖5所示.BSA的圓二色譜在208和222nm處顯示有兩個負峰,是BSA中α-螺旋結(jié)構(gòu)的特征峰,它們的強度可以反映BSA中α-螺旋的含量.α-螺旋的含量可以通過以下兩個公式計算得到:式中,θobs是圓二色譜的毫度值,n為氨基酸殘基的個數(shù)(583),l是比色皿的寬度,Cp是BSA的摩爾濃度,MRE208為在208nm處的MRE值.當逐漸增加日落黃的濃度時,圓二色譜圖中BSA在208和222nm處的負峰的強度減弱,但峰型基本保持不變,這說明日落黃與BSA的相互作用導致蛋白質(zhì)多肽鏈的重排,蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生變化,但是此時BSA還是以α-螺旋結(jié)構(gòu)為主.通過式(5)和式(6),計算得到BSA中α-螺旋結(jié)構(gòu)的含量由65.86%減少至54.67%,這表明日落黃和BSA分子的主要多肽鏈上的氨基酸殘基結(jié)合,對BSA中因氫鍵作用而形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有一定的破壞,致使構(gòu)成α-螺旋的肽段伸展開來,轉(zhuǎn)變?yōu)檩^為松散的二級結(jié)構(gòu),從而減小其疏水性.3日落黃與bsa的相互作用本文采用熒光光譜法、紫外吸收光譜法、紅外光譜法和圓二色譜法研究兩種食用色素日落黃和β-胡蘿卜素與BSA的相互作用,并比較兩者與BSA相互作用過程的差異性.(1)熒光猝滅實驗得出,日落黃和β-胡蘿卜素對BSA的猝滅作用都是靜態(tài)猝滅,