銅綠假單胞菌感染和耐藥機制

銅綠假單胞菌感染和耐藥機制銅綠假單胞菌是革蘭氏陰性桿菌，是條件致病菌，它對健康的機體幾乎不會引起感染，但是對免疫受損的機體可以引起嚴(yán)重的感染，免疫受損的機體包括囊性纖維化患者，癌癥病人，艾滋病毒感染者，嚴(yán)重?zé)齻∪薣1]。由于傳統(tǒng)的抗生素治療，使銅綠假單胞菌對許多抗生素產(chǎn)生了嚴(yán)重的耐藥性，它可以產(chǎn)生各種滅活酶或修飾酶,如內(nèi)酰胺酶等;菌體蛋白結(jié)構(gòu)和功能改變逃避抗菌藥物作用;膜屏障與主動排外;形成生物保護(hù)膜等[4]，來抵制抗生素的作用。這也是在臨床上很棘手的問題，使銅綠假單胞菌不僅成為難以治療的病原菌，也使其成為眾多研究細(xì)菌致病性和耐藥性的對象。首先來了解一下銅綠假單胞菌引起的常見的感染和疾病。1、銅綠假單胞菌引起的常見的感染和疾病在臨床上發(fā)現(xiàn)呼吸科和燒傷科銅綠假單胞菌感染率和檢出率較高。銅綠假單胞菌相關(guān)性肺炎它包括慢性阻塞性肺疾病(COPD)，醫(yī)院獲得性肺炎(CAP，呼吸機相關(guān)性肺炎(VAP),氣管鏡相關(guān)性肺炎，囊性纖維變性(CF等。慢性阻塞性肺疾病(COPD)慢性阻塞性肺疾病(COPD)是以感染為主要表現(xiàn)的疾病,由于其呼吸道防御功能下降,支氣管清除能力減弱,故能引起多種細(xì)菌的感染，銅綠假單胞菌感染是COPD病人急性加重的主要原因。銅綠假單胞菌一開始就被認(rèn)為是引起慢性阻塞性肺疾病(COPD的重要的致病菌[10],Laura的研究證明銅綠假單胞菌引起COP爾人的慢性感染[11]。醫(yī)院獲得性肺炎(CAP)銅綠假單胞菌在社區(qū)獲得性肺炎中不常見，但在醫(yī)院獲得性肺炎(CAP中較常見的病原菌之一[2]。CAP是COPD常見并發(fā)癥和重要死亡原因之一，近年來國內(nèi)關(guān)于COPD患者合并CAP方面的研究得到廣泛關(guān)注。同時由于社會人口的老齡化、免疫損害宿主增加、病原菌變遷和抗菌藥物耐藥率上升等原因,其致病菌的組成和耐藥特性在不同國家、不同地區(qū)之間存在著明顯差異而且隨著時間的推移而不斷變遷[6]。呼吸機相關(guān)性肺炎(VAP)機械通氣已成為重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)救治呼吸衰竭患者的重要手段,隨之而來的呼吸機相關(guān)性肺炎(VAP)日益受到人們的重視。銅綠假單胞菌已成為VAP的主要致病菌,其具有多藥耐藥性,治療難度大,病死率高。由于銅綠假單胞菌在醫(yī)院環(huán)境中廣泛分布,常見于醫(yī)務(wù)人員的手、病床、桌面、呼吸機管路、各種醫(yī)用導(dǎo)管及醫(yī)療用品的表面等,使得機械通氣患者成為銅綠假單胞菌感染的易感人群。該菌所致的感染大多發(fā)生在免疫功能低下且伴有嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病的患者，如高齡、COPD患者、腦外傷或腦血管意外患者,較大創(chuàng)傷對自身免疫力的削弱以及氣管插管或氣管切開、機械通氣、留置導(dǎo)尿等侵入性操作,均使感染的機會大大增加[5]。燒燙傷后感染燒燙傷患者嚴(yán)重感染已成為影響其健康、甚至導(dǎo)致死亡的重要原因之一，30年來感染一直占據(jù)死亡原因的首位[12]，燒傷后的感染是一個很重要的問題，因為一旦感染上醫(yī)院獲得性的多重耐藥性細(xì)菌，將是一個很麻煩的事情。在燒傷感染細(xì)菌菌種多以革蘭陰性桿菌為主,其中以銅綠假單胞菌的檢出率最高。各地報道顯示,該菌的檢出率牢牢占據(jù)革蘭陰性桿菌的首位[13-14],成為燒傷創(chuàng)面感染常見細(xì)菌之一。銅綠假單胞菌適應(yīng)性很強，它對不少抗生素有天然耐藥性，這使得它可以定植在燒傷部位并可以快速增殖，而這種局部的增殖可以導(dǎo)致全身的膿毒血癥，而膿毒血癥又可導(dǎo)致高的死亡率。[15]這些疾病在臨床上一旦出現(xiàn)非常棘手，因為銅綠假單胞菌適應(yīng)性很強，它對不少抗生素有天然耐藥性和后天獲得的多重高度耐藥性，臨床治療十分困難,一旦感染,病死率很高。耐藥機制銅綠假單胞菌耐藥機制相當(dāng)復(fù)雜,已知的主要有:(1)青霉素結(jié)合蛋白(PBPs)結(jié)構(gòu)和功能的改變以及與抗菌藥物親和力的下降。(2)外膜通透性降低。(3)B-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生。(4)氨基糖苷類修飾酶的產(chǎn)生。(5)細(xì)胞外膜主動外排系統(tǒng)的表達(dá)。另外(6)銅綠假單胞菌生物膜的形成也使其對抗菌藥物不敏感[6]細(xì)胞外膜主動外排系統(tǒng)銅綠假單胞菌外排泵是由相同的操縱子所編碼的內(nèi)膜轉(zhuǎn)運體（如MexBMexDMexFMexYMexl和MexW和MFP以及由相同的操縱子或染色體其他區(qū)域的基因所編碼的 0M蛋白共同形成的一種貫穿內(nèi)外膜的通道，該通道能夠直接將靶物質(zhì)從細(xì)胞質(zhì)泵至細(xì)胞外環(huán)境。銅綠假單胞菌外排系統(tǒng)包括 MexAB-OprM型和MexCD-OprJ型，主導(dǎo)致菌株獲得性的對多種藥物耐藥的原因是MexAB-OprM的過度表達(dá)。主動外排系統(tǒng)MexAB-OprM的高表達(dá)對美羅培南的耐藥起重要作用，其高表達(dá)與調(diào)控基因 mexR變異有關(guān)，MexAB-OprM高表達(dá)的分子機制可能與泵調(diào)節(jié)基因 MexR的突變以及其他突變型有關(guān)［17］，MexAB-OprM主動外排系統(tǒng)表達(dá)水平的增高與PA多藥耐藥的形成密切相關(guān)［18-19］。B-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生，銅綠假單胞菌產(chǎn)生三種B-內(nèi)酰胺酶，包括超廣譜B-內(nèi)酰胺酶（ESBL）,誘導(dǎo)酶（AmpC酶），金屬p-內(nèi)酰胺酶。其中金屬P-內(nèi)酰胺酶可以水解亞胺培南，導(dǎo)致其耐藥，而亞胺培南被認(rèn)為是治療銅綠假單胞菌等感染的重要武器，目前發(fā)現(xiàn)的獲得性金屬P-內(nèi)酰胺酶包括：IMP、VIM、GIMSPM4種，其中以IMP和VlM常見,lMP-7（GenBankAF318077）其產(chǎn)生菌對美洛培南和亞胺培南高度耐藥［24］。產(chǎn)ESBLs不易被忽視,國外報道銅綠假單胞菌產(chǎn)超廣譜p-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）的檢出類型已達(dá)150余種，其中，以O(shè)XA型增長最快，OXA-50在銅綠假單胞菌的表達(dá)可降低氨芐西林、替卡西林、拉氧頭孢和美洛培南的敏感性[20]。國內(nèi)徐衛(wèi)等報道在銅綠假單胞菌中,ESBLs的檢出率已高達(dá)38-23%[21-23]。有文獻(xiàn)報道，銅綠假單胞菌染色體固有攜帶ampC基因，但基因的表達(dá)受誘導(dǎo)劑（抗生素）調(diào)節(jié)，促使AmpC酶的產(chǎn)生，一旦去除抗生素，大多數(shù)情況下產(chǎn)酶水平水逐漸恢復(fù)到基線水平[28]。但當(dāng)ampC基因自發(fā)突變可致穩(wěn)定的去阻遏表達(dá)而產(chǎn)生持續(xù)性的高水平酶[29]。外膜通透性降低OprD2蛋白形成的特異性孔道,可以促使碳青霉烯類抗菌藥物進(jìn)入銅綠假單胞菌細(xì)胞內(nèi)部,oprD2基因的缺少或者不表達(dá)會導(dǎo)致碳青霉烯類抗菌藥物（除美羅培南外）對銅綠假單胞菌不起作用[25]。衣美英等[16]測定該院SICU分離的49株P(guān)A，其結(jié)果顯示:對碳青霉烯耐藥主要是由外膜蛋白OprD表達(dá)降低或缺失引起，與IMP、VIM金屬酶無關(guān)。鄒德勝等[26]通過對26株耐亞胺培南銅綠假單胞菌進(jìn)行oprD2基因的PCR擴增，顯示其中有20株為膜孔蛋白o(hù)prD2基因缺失。這一結(jié)果說明oprD2基因的缺失應(yīng)該是亞胺培南對銅綠假單胞菌不起作用的主要原因[27] 。氨基糖苷類修飾酶與16SrRNA甲基化酶的產(chǎn)生酶修飾是氨基糖苷類抗生素最常見的耐藥機制，經(jīng)酶修飾的抗生素與細(xì)菌16SrRNA上的A位點的結(jié)合力下降，從而導(dǎo)致藥物抗菌活性的喪失[31]。依據(jù)其修飾功能的不同可分為3類，即氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶(aminoglycosidephosphotransferases，APH)、氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶(Aminoglycosideacetyltransferases ，AAC)和氨基糖苷類核苷轉(zhuǎn)移酶(aminoglycosidenucleotidyltransferases ，ANT)[32]。銅綠假單胞菌具有編碼這3類修飾酶的基因[33]。16SrRNA甲基化酶是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的由質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥機制，與臨床上常見的氨基糖苷類修飾酶不同，氨基糖苷類修飾酶具有底物特異性，因此，細(xì)菌同時對多種氨基糖苷類抗生素產(chǎn)生持續(xù)耐藥比較少見，而甲基化酶修飾的是所有氨基糖苷類共同的作用位點，一旦修飾發(fā)生，目前使用的一切氨基糖苷類抗生素都將失去作用，并且耐藥菌的MIC往往高達(dá)512?1024mg/L。這種新的耐藥機制的出現(xiàn)，打破了以往的認(rèn)識，微生物學(xué)家們驚呼“前所未有的”危險的氨基糖苷類耐藥菌株不久將在全球播散，必須引起臨床高度關(guān)注。2002年，日本學(xué)者Yokoyama等對1株分離自1997年的銅綠假單胞菌的研究中，發(fā)現(xiàn)其對阿貝卡星(卡那霉素的衍生物)高度耐藥，介導(dǎo)銅綠假單胞菌對阿貝卡星高度耐藥的是這種新的氨基糖苷類耐藥機制――16SrRNA甲基化酶，(RmtA)，并且該酶的編碼基因和超廣譜 B-內(nèi)酰胺酶CTX-M-3編碼基因位于同一接合性質(zhì)粒上[30]。銅綠假單胞菌生物膜的形成生物被膜是細(xì)菌為適應(yīng)自然環(huán)境而形成的，系指細(xì)菌吸附于生物材料或機體腔道表面，分泌多糖基質(zhì)、纖維蛋白、脂蛋白等，將其自身包繞其中形成的膜樣物[36]。銅綠假單胞菌為臨床產(chǎn)生細(xì)菌生物被膜相關(guān)感染最常見的致病菌,銅綠假單胞菌在體內(nèi)粘膜、各種插管、病房物表等上形成的生物膜,這與銅綠假單胞菌引起的感染,特別是肺部感染,很難被清除,常常導(dǎo)致感染的反復(fù)發(fā)作有很大的關(guān)系。銅綠假單胞菌在濕潤環(huán)境下,浮游細(xì)菌可吸附于固體的表面,形成微菌落,并合成分泌大量胞外多糖基質(zhì),進(jìn)而微菌落分化為由胞外多糖包裹的成熟生物膜[34]。粘液型銅綠假單胞菌，其主要成份藻酸鹽是形成生物被膜的重要基礎(chǔ)，藻酸鹽使細(xì)菌牢固粘附于肺上皮表面形成生物被膜，一方面可抵御單核―巨噬細(xì)胞的吞噬作用，另一方面可抵制抗菌藥物的殺滅作用[37]。而非粘液型的銅綠假單胞菌在滲透壓高、氯化鈉較多、磷酸鹽少的條件下，容易轉(zhuǎn)化為粘液型[38]。銅綠假單胞菌生物被膜的形成是難治性肺部感染的重要原因，死后肺組織的電鏡分析亦顯示銅綠假單胞菌在患者的肺部形成微菌落[39]。藥物研究抑制銅綠假單胞菌主動外排銅綠假單胞菌廣泛耐藥的主要原因是主動外排系統(tǒng)，而解決其廣泛耐藥的重要措施是抑制主動外排．但是許多在體外活性良好的外排泵抑制劑由于安全性、特異性、機制明確性等諸多問題并未能像B-內(nèi)酰胺酶抑制劑在臨床廣泛應(yīng)用.但我們相信通過對各種抑制外排方法的研究，尤其是對基因靶向干預(yù)治療研究的不斷深入和發(fā)展，可以在不久的將來較好地解決多藥外排介導(dǎo)的抗菌藥物耐藥問題，并取得較為理想的效果。干擾QS系統(tǒng)QS(quorumsensing)是具有進(jìn)化優(yōu)勢的BF信息傳導(dǎo)機制,代表了細(xì)菌為控制能感應(yīng)自身密度的特殊基因而專用的一種信息交流系統(tǒng),干擾和破壞QS是從基因分子水平防治生物膜的研究熱點。研究發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌生物被膜QS的抑制物可以抑制生物被膜的形成。Kim等[35]通過模擬呋喃酮的結(jié)構(gòu),合成一系列的5-氧-2,5二氫呋喃-3-烴基類似物,這些合成物抑制QS的程度從20%-90%F等，進(jìn)而抑制生物被膜的形成。實驗前模型中預(yù)測的QS受體LasR與抑制物之間的結(jié)合能和通過實驗得到的數(shù)據(jù)高度一致,為解釋干擾QS的機制提供了科學(xué)依據(jù)。C8-CPA(N-Octanoylcyclopentylamide)是銅綠假單胞菌PAO1信號感應(yīng)系統(tǒng)的抑制物。通過合成一系列 C8-CPA的結(jié)構(gòu)類似物來研究對PAO1的抑制能力。研究發(fā)現(xiàn):抑制能力的強弱與抑制物的長度和環(huán)狀結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。在合成的類似物中,C10-CPA(N-Decanoylcyclopentylamide) 抑制了毒力因子如彈性酶、綠膿菌素和鼠李糖脂的產(chǎn)物，是PAO1生物被膜的最強抑制物[8] 。從中藥中篩選銅綠假單胞菌生物膜的抑制物孔晉亮等[40]通過實驗證實了黃芩水煎液對銅綠假單胞菌黏附力及生物膜形成均有抑制作用,作用效果與紅霉素標(biāo)準(zhǔn)粉劑相當(dāng)。陳一強[41]等的研究結(jié)果表明金銀花能破壞銅綠假單胞菌的早期和成熟生物膜,對頭孢他