黃芪多糖的提取及分離純化研究

黃芪多糖的提取及分離純化研究

中藥黃是豆科植物膜中黃鼠尾和蒙古黃鼠尾的干燥根。具有益中、調(diào)陽、固外、托毒、舒肌、利尿、止瀉的功效。主要理學(xué)成分為茶多酚、糖苷、黃酮、各種氨基酸和微量元素。黃芪多糖是黃芪的有效成分之一,是從黃芪根中得到的一類大分子活性物質(zhì)?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,黃芪多糖具有抗衰老、抗過氧化、增強免疫功能、改善心血管功能、抗腫瘤等作用,能增加機體的非特異性抵抗能力,臨床常用作免疫增強劑。臨床上多用水直接煎煮法提取黃芪多糖,但收率和純度均較低,為了更好地開發(fā)和利用黃芪多糖,對其提取和純化工藝進行了進一步的研究。1材料和方法1.1儀器、試劑和儀器殼聚糖(青島海得貝生物工程有限公司),Ⅱ型ZTC1+1天然澄清劑(天津正天成澄清技術(shù)有限公司),UV2102PCS紫外分光光度計(尤尼柯上海儀器有限公司),AUW220D電子分析天平(日本島津公司),DZF-2型真空干燥箱(北京市光明醫(yī)療儀器廠),所用試劑均為分析純。黃芪藥材(購于河南省藥材公司),經(jīng)河南中醫(yī)學(xué)院董誠明教授鑒定,為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao的干燥根。1.2提取醫(yī)療用品的方法1.2.1黃芪多糖的提取取黃芪藥材800g,分別加12倍、10倍水煎煮2次,抽濾,合并2次濾液,減壓濃縮至800mL,從中取出200mL加適量95%乙醇,使最終含醇量為80%,過夜,抽濾,沉淀依次用丙酮、無水乙醇洗滌,得黃芪多糖粗品。1.2.2黃芪多糖的提取取黃芪藥材400g,分別加12倍、10倍量用NaOH調(diào)pH為12的堿水煎煮2次,抽濾,合并2次濾液,調(diào)pH值為中性,減壓濃縮至400mL,從中取出200mL加適量95%乙醇使最終含醇量為80%,過夜,抽濾,沉淀依次用丙酮、無水乙醇洗滌,得黃芪多糖粗品。1.2.3黃芪多糖的提取取黃芪藥材200g,分別加12倍、10倍量用CaO調(diào)pH為12的堿水煎煮2次,抽濾,合并2次濾液,調(diào)pH值為中性,減壓濃縮至200mL,然后加適量95%乙醇,使最終含醇量為80%,過夜,抽濾,沉淀依次用丙酮、無水乙醇洗滌,得黃芪多糖粗品。1.2.4黃芪多糖的提取取黃芪藥材200g,分別加12倍、10倍量用NaOH調(diào)pH為12的含5%乙醇的堿醇回流提取2次,抽濾,合并2次濾液,調(diào)pH值為中性,減壓濃縮至200mL,然后加適量95%乙醇,使最終含醇量為80%,過夜,抽濾,沉淀依次用丙酮、無水乙醇洗滌,得黃芪多糖粗品。1.2.5黃芪多糖的提取取黃芪藥材200g,分別加12倍、10倍量用CaO調(diào)pH為12的含5%乙醇的堿醇回流提取2次,抽濾,合并2次濾液,調(diào)pH值為中性,減壓濃縮至200mL,然后加適量95%乙醇,使最終含醇量為80%,過夜,抽濾,沉淀依次用丙酮、無水乙醇洗滌,得黃芪多糖粗品。1.3純度方法1.3.1皮聚糖懸浮劑的制備稱取1g殼聚糖,用100mL1%的醋酸水溶液加熱攪拌進行溶解,即得100mL1%的殼聚糖絮凝劑。1.3.21天然清算劑zec1A組分:用蒸餾水配成體積分?jǐn)?shù)1%的溶液50mL;B組分:用1%的乙酸配成體積分?jǐn)?shù)1%的溶液50mL。1.3.3黃芪多糖的純化取200mL水提得到的黃芪多糖溶液,用NaOH調(diào)pH到10.54,靜置過夜,抽濾除去沉淀,同時把下層濾液用10%硫酸調(diào)pH值為5.44,靜置過夜,過濾,加適量95%乙醇,使最終含醇量達(dá)到80%,靜置過夜,抽濾,沉淀依次用丙酮、無水乙醇洗滌,得初步純化后的黃芪多糖。1.3.4殼聚糖絮凝后黃芪多糖的制備取200mL水提得到的黃芪多糖溶液,按黃芪多糖濃縮液體積的20%加入殼聚糖絮凝劑,攪拌20min后靜置40min,抽濾得到濾液,然后加適量95%乙醇,使最終含醇量為80%,過夜,抽濾,沉淀依次用丙酮、無水乙醇洗滌,減壓干燥得到殼聚糖絮凝除雜后的黃芪多糖。1.3.5提取多糖、干燥多糖將殼聚糖絮凝除雜后的黃芪多糖80℃水浴2h后,先加入B組分,每30min攪拌1次,2h后加入A組分,1h后攪拌1次,2h取出,離心10min(3000r/min),上清液加適量95%乙醇,使含醇量達(dá)到80%,靜置過夜,沉淀用丙酮、無水乙醇洗滌數(shù)次,減壓干燥得到多糖。1.4黃棕櫚糖含量1.4.1葡萄糖溶液的制備精密稱取干燥至恒定質(zhì)量的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0.10007g,定溶于1000mL容量瓶中,即得葡萄糖標(biāo)液。1.4.2hco30.5%餾分溶液取苯酚100g,加鋁片0.1g和NaHCO30.05g,蒸餾,收集182℃餾分,稱取5.0g,定溶于100mL棕色容量瓶中,冰箱內(nèi)冷藏備用。1.4.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別精密移取葡萄糖標(biāo)液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL置于10mL容量瓶中,補充水分至1mL,然后分別加5%苯酚溶液1mL,濃硫酸5mL,迅速振搖,水浴鍋中100℃保溫20min,取出后放至室溫,同時做一空白對照,于490nm處測定吸收度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程:A=0.008731C+0.008200,r=0.9992。1.4.4苯酚含量測定分別將提取得到的黃芪多糖,置放于有P2O5的真空干燥箱中,減壓干燥至恒定質(zhì)量,再分別從中精密稱取0.05g,定溶于500mL容量瓶中,然后分別從中精密移取0.5mL至10mL容量瓶中,補充水分至1mL,再分別加入5%苯酚溶液1mL,然后迅速滴加濃硫酸5mL,充分振搖,水浴鍋中100℃保溫20min,取出放至室溫,同時做一空白對照,于490nm處測定吸收度,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線A=0.008731C+0.008200,r=0.9992,計算含量。2種提取方法的提取效果及樣品測定從表1可以看出,NaOH醇提醇沉的提取法所得多糖量、多糖純度、多糖收率都高于其他4種提取方法;水提Ⅱ型ZTC1+1天然澄清劑除雜的純化方法所得多糖純度最高,但多糖量及多糖收率相對較低。3不同提取方法多糖提取效率1)從提取方法來看,堿醇提醇沉的提取效率要明顯高于直接水提。這是因為堿對植物細(xì)胞壁起到破壁作用,且在堿性條件下纖維之間的酯鍵易斷裂而發(fā)生剝皮反應(yīng),使更多的多糖得以游離而被提取出來。醇的滲透作用較強,在堿與醇的共同作用下,增加了多糖滲透率,降低了多糖的殘留量,因而達(dá)到了提高多糖提取效