干細(xì)胞標(biāo)記論文

SPIO標(biāo)記人胚胎干細(xì)胞皮下注射小鼠的示蹤研究【摘要】目的：探討超順磁性氧化鐵微粒（SPIO）體外標(biāo)記人胚胎干細(xì)胞（ESC）及體內(nèi)示蹤皮下注射裸鼠的人胚胎干細(xì)胞的能力。方法：使用硫酸魚精蛋白-SPIO共培養(yǎng)方式標(biāo)記人胚胎干細(xì)胞。采用顯微鏡觀察干細(xì)胞標(biāo)記情況，并進(jìn)行富集純化，將經(jīng)過SPIO標(biāo)記的干細(xì)胞皮下注射裸鼠體內(nèi)，應(yīng)用1．5TMRI系統(tǒng)進(jìn)行磁標(biāo)記干細(xì)胞成像。結(jié)果：初步標(biāo)記后的人胚胎干細(xì)胞用顯微鏡觀察，SPIO標(biāo)記的干細(xì)胞細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)細(xì)小的黑色鐵顆粒，標(biāo)記效率為90％；標(biāo)記了SPIO的人胚胎干細(xì)胞體內(nèi)MRI成像時(shí)顯示，細(xì)胞移植區(qū)域T2信號(hào)減弱。結(jié)論：SPIO能成功地標(biāo)記ESC，SPIO標(biāo)記的ESC皮下注射入小鼠體內(nèi)的分布、遷移過程可用MRI進(jìn)行檢測評(píng)價(jià)?！娟P(guān)鍵詞】干細(xì)胞移植；示蹤；超順磁性氧化鐵；磁共振成像；標(biāo)記近些年來，胚胎干細(xì)胞的研究一直是生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)中的熱點(diǎn)。胚胎干(embryonicstem,ES)細(xì)胞因具有全能性和無限增殖的能力而有望成為組織工程中種子細(xì)胞的新來源[1]。但是,ESC目前尚不能真正應(yīng)用于臨床治療,還有許多問題亟待解決。其中,較為突出的是如何對移植的干細(xì)胞進(jìn)行長期的、無創(chuàng)傷的實(shí)時(shí)檢測,從而了解其在體內(nèi)的分布、遷徙、分化和轉(zhuǎn)歸等生物學(xué)行為。本實(shí)驗(yàn)用SPIO標(biāo)記人的胚胎干細(xì)胞，并通過皮下注射小鼠體，用MRI檢測其增殖分化特性。核磁共振成像(MagneticResonanceImaging，MRI)是分子影像學(xué)的一種技術(shù)，增加了本實(shí)驗(yàn)過程細(xì)胞移植的無創(chuàng)活體示蹤的可行性。根據(jù)成像方法不同，分子成像主要包括核素分子成像、磁共振(magneticresonance,MR)分子成像、光學(xué)分子成像等。因MR成像具有無放射性,有較高的軟組織分辨能力和良好的重復(fù)性而倍受推崇[2]。超順磁性氧化鐵微粒(superparamgneticironoxides，SPIO)為一種納米分子探針，具有因良好的生物相容性和磁共振信號(hào)敏感性而被應(yīng)用于該實(shí)驗(yàn)中。細(xì)胞通過吞噬、吞飲等方式將納米粒子內(nèi)吞于細(xì)胞體內(nèi)，而對不具有吞噬能力或吞噬能力較弱的細(xì)胞,由于標(biāo)記率低而不能直接將此類造影劑用于細(xì)胞的標(biāo)記。磁性納米粒子表面修飾被認(rèn)為是磁性納米粒子與細(xì)胞膜表面非特異性相互作用的關(guān)鍵因素,影響細(xì)胞標(biāo)記率[1]，并且磁性粒子的粒徑影響磁共振靈敏度，磁性納米簇與單個(gè)納米粒子相比能顯著增強(qiáng)MRI信號(hào)[2-4]。本研究選擇微米級(jí)超順磁氧化鐵顆粒(SPIO)標(biāo)記小鼠胚胎干細(xì)胞(ESC)及其分化的心肌細(xì)胞并行MR顯像，以檢測標(biāo)記的有效性和對細(xì)胞生物學(xué)活性影響。1材料與方法1．1材料裸鼠、硫酸魚精蛋白、SPIO、1．5TMRI1．2方法1．2．1混合液的配制1.先稱取10mg的硫酸魚精蛋白溶于10ml的蒸餾水中；2.用槍吸取0.3ml的SPIO溶于20ml的無血清的培養(yǎng)基中；3.取1中已配制的溶液100ul加入2中溶液中，使硫酸魚精蛋白濃度為5ug/ml；4.往3中的溶液加入等體積的雙倍血清培養(yǎng)基，使最終SPIO的濃度為50ugFe/ml,即所需溶液。1．2．2干細(xì)胞的體外標(biāo)記及富集6天之后，兩種細(xì)胞長到大約整個(gè)瓶壁的60%，即用我們預(yù)先配制好的混合液給細(xì)胞換液，孵育過夜，接下第二天，觀察磁珠標(biāo)記的情況，并拍照，大多數(shù)細(xì)胞均被標(biāo)記。為了得到更高的標(biāo)記效率，第三天我們又進(jìn)行了富集純化，富集過程如下：1.用胰酶消化細(xì)胞，加入3ml的培養(yǎng)基，并將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到15ml的玻璃離心中，15000rpm離心5min，棄上清；2.加入新的培養(yǎng)基打勻細(xì)胞，用強(qiáng)力磁石富集，棄上清，重復(fù)2次；3.加入2.5ml新培養(yǎng)基打勻之后轉(zhuǎn)移至小培養(yǎng)皿中，4小時(shí)之后細(xì)胞貼壁之后觀察，并進(jìn)行拍照，觀察富集情況，對比富集前后的磁珠標(biāo)記的情況，富集后幾乎每個(gè)細(xì)胞均被標(biāo)記。1.2.3收集標(biāo)記的細(xì)胞，制成100ul懸液，皮下注射小鼠左腋下，2周后進(jìn)行核磁共振成像2結(jié)果2．1SPIO標(biāo)記干細(xì)胞的結(jié)果干細(xì)胞的超順磁氧化鐵顆粒標(biāo)記：電鏡顯示ESC胞質(zhì)內(nèi)散在分布許多囊泡樣結(jié)構(gòu)即吞飲小泡，高密度鐵顆粒主要集中在囊泡內(nèi)，直徑大約0．8～1．5m(圖1)。鏡檢可見ESC胞漿內(nèi)存在大量黑色的SPIO顆粒，細(xì)胞標(biāo)記率為90％（圖1）定位、存活數(shù)量、移植細(xì)胞的分化等。但組織學(xué)是有創(chuàng)檢查，而且不能代表全部移植細(xì)胞的體內(nèi)生存情況及其動(dòng)態(tài)遷移[3]。干細(xì)胞移植的臨床應(yīng)用及相關(guān)科學(xué)研究需要合適的影像學(xué)方法對移植細(xì)胞在活體進(jìn)行連續(xù)、無創(chuàng)的示蹤觀察[16]活體示蹤移植干細(xì)胞的生存狀態(tài)及遷移對闡明治療效果的潛在機(jī)制及臨床應(yīng)用的實(shí)施有極其重要的作用。MR有良好的軟組織及時(shí)間分辨率，無電離輻射，可以在示蹤干細(xì)胞的同時(shí)評(píng)價(jià)干細(xì)胞移植的治療效果，MR透視引導(dǎo)下精確移植定位的研究已見報(bào)道[17]。MRI因其諸多優(yōu)勢在活體干細(xì)胞監(jiān)測領(lǐng)域成為研究熱點(diǎn)。SPIO對標(biāo)記細(xì)胞毒性低，細(xì)胞增殖不受影響。與未標(biāo)記細(xì)胞相比，標(biāo)記干細(xì)胞的細(xì)胞活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致［18］。參考文獻(xiàn)[1]沈干，從笑倩，汪錚，吳春芳，曹誼林小鼠胚胎干細(xì)胞建系及GFP標(biāo)記東南大學(xué)學(xué)報(bào).2003,Mar;22(2):71O74,88[2]MatuszewskiL,TombachB,HeindelW,etal.Molecularandparame-tricimagingwithironoxides[J].Radiologe,2007,47(1):34-42.[3]FrankJA,MillerBR,ArbabAS,etal.Clinicallyapplicablelabelingofmammalianandstemcellsbycombiningsuperparamagneticironoxidesandtransfectionagents.Radiology.2003;228(2):480-487.[4]ArbabAS,BashawLA,MillerBR,etal.CharacterizationofbiophysicalandmetabolicpropertiesofcellslabeledwithsuperparamagneticironoxidenanoparticlesandtransfectionagentforcellularMRimaging.Radiology.2003;229(3):838-846.[5]BosC,DelmasY,DesmoulièreA,etal.InvivoMRimagingofintravascularlyinjectedmagneticallylabeledmesenchymalstemcellsinratkidneyandliver.Radiology.2004;233(3):781-789.[6]KosturaL,KraitchmanDL,MackayAM,etal.Feridexlabelingofmesenchymalstemcellsinhibitschondrogenesisbutnotadipogenesisorosteogenesis.NMRBiomed.2004;17(7):513-517.[7]BulteJW，KraitchmanDL.IronoxideMRcontrastagentsformolecularandcellularimaging[J].NMRBiomed,2004,17(7):484-499.[8]EmeritJ,BeaumontC,TrivinF.Ironmetabolism,freeradicals,andoxidativeinjury[J].BiomedPharmacother,2001,55(6):333-339.[9]LuCW,HungY,HsiaoJK,etal.Bifunctionalmagneticsilicananoparticlesforhighlyefficienthumanstemcelllabeling[J].NanoLett,2007,7(1):149-154.[10]Daldrup-LinkHE,RudeliusM,OostendorpRA,etal.TargetingofhematopoieticprogenitorcellswithMRcontrastagents[J].Radiology,2003,228(3):760-767.[11]金旭紅，楊柳，段小軍，等．體外納米磁帶標(biāo)注骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生特學(xué)特性及其MR成像［J］．第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，30（4）：275－279．[12]劉再毅，王瑛，王廣誼，等．超順磁性氧化鐵標(biāo)記脂肪干細(xì)胞移植入大鼠心臟后的活體磁共振示蹤成像［J］．中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，31（2）：187－191．[13]NeriM，MademaC，CavazzinC，etal．Eficientinvitrolabelingofhumanneuralprecursorcellswithsuperparagnetieironoxideparticles：relevanceforinvivocelltracking［J］．StemCell，2008，26（2）：505－516．[14]黃鈾新，呂富榮，呂發(fā)金，等．超順磁性氧化鐵標(biāo)記大鼠骨髓問充質(zhì)干細(xì)胞的磁共振成像研究［J］．重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，34（3）：318－321．[15]KraitchmanDL,BulteJW.ImagingofstemcellsusingMRI.BasicResCardiol.2008;103(2):105-113.[16]BaiX,AltE.Myocardialregenerationpotentialofadiposetissue-derivedstemcells.BiochemBiophysResCommun.2010;