多靶點pCRISPR載體單子葉和雙子葉植物用使用方法

CRISPR/Cas9-basedgenomeeditingtechnologyArobustCRISPR/Cas9vectorsystemformultiple*targetingofgenomicsitesinmonocotanddicotplants亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點實驗室華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院耀光課題組(.)pYLCRISPR/Cas9多靶點載體介紹CRISPR/Cas9是新近開展的基因組編輯技術(shù)〔圖1〕。CRISPR/Cas9切割靶序列僅需要single-guideRNA(sgRNA)以及由sgRNA引導(dǎo)的Cas9蛋白，比鋅指核酸酶〔ZFNs〕，TALENs更加簡便，高效，因而成為基因組編輯工具的首選。我們利用CRISPR/Cas9技術(shù)可方便地進(jìn)展多重靶向的特征，構(gòu)建了一套用于單子葉和雙子葉植物的多靶點CRISPR/Cas9基因打靶載體系統(tǒng)。本套載體將Cas9蛋白表達(dá)盒整合到雙元載體上，用于裝載多個sgRNA表達(dá)盒的多克隆位點BsaI位于靠近雙元載體RB位置。sgRNA表達(dá)盒元件設(shè)在中間質(zhì)粒載體上，利用酶切連接和PCR方法拼裝好，再利用GoldenGate或GibsonAssembly克隆方法組裝到雙元載體上。Figure1.AworkingmodeloftheCRISPR/Cas9system.TheCas9-sgRNAple*locatestothetargetsitetocleavetheDNAtoproducedoublestrandbreak(DSB).2．CRISPR/Cas9載體與sgRNA載體圖譜2.1CRISPR/Cas9雙元載體本套載體系統(tǒng)的雙元載體骨架為pCAMBIA-1300(ACCESSION:AF234296)，Cas9p為本實驗室設(shè)計合成的植物優(yōu)化密碼子基因，它模擬了禾本科植物基因具有5’端GC含量較高的特征(Figure2)。這些質(zhì)粒在E.coliTOP10F’(LacIq)菌株繁殖，該菌株LacIq基因型產(chǎn)生的阻礙蛋白可抑制ccdB大腸桿菌致死基因的表達(dá)。pYLCRISPR/Cas9Pubi-H,-B載體中的Cas9p用pUbi驅(qū)動，優(yōu)選用于單子葉植物的基因打靶；對于雙子葉植物，目前優(yōu)先使用pYLCRISPR/Cas9P35S-H,-N,-B。我們用pYLCRISPR/Cas9Pubi-H在擬南芥也打靶成功，但與pYLCRISPR/Cas9P35S-H對擬南芥的打靶效率比擬正在測試中。我們對pYLCRISPR/Cas9載體采用了新的命名，與舊的命名對應(yīng)關(guān)系見表1。Figure2.ACRISPR/Cas9systemformonocotanddicotplants.pYLCRISPR/Cas9Pubi-H,-B(above);pYLCRISPR/Cas9P35S-H,-N,-B(below);HPT(-H),Bar(-B),andNPTII(-N)encodehygromycinBphosphotransferase,PPTacetyltransferaseandneomycinphosphotransferaseII,respectively.NLS,nuclearlocalizationsequence.ThekeysequencesincludingrestrictionsitesforcloningandanalysisofsgRNAe*pressioncassettesaregiven.TwoBsaI-cuttingsties[BsaI(B-L)andBsaI(B-R)]forcloningthesgRNAe*pressioncassettesareseparatedbyashortenformoftheccdBnegativeselectiongene.表一pYLCRISPR/Cas9載體新舊命名對應(yīng)關(guān)系新命名原命名適用植物種植物抗性pYLCRISPR/Cas9Pubi-HpYLCRISPR/Cas9-MH,pYLCRISPR/Cas9-MTmono單子葉/雙子葉潮霉素pYLCRISPR/Cas9Pubi-BpYLCRISPR/Cas9-MB單子葉/雙子葉草甘磷pYLCRISPR/Cas9P35S-HpYLCRISPR/Cas9-DH雙子葉潮霉素pYLCRISPR/Cas9P35S-BpYLCRISPR/Cas9-DB雙子葉草甘磷pYLCRISPR/Cas9P35S-NpYLCRISPR/Cas9-DN雙子葉卡那霉素2.2CRISPR/sgRNAvectorssgRNA序列全長96nt，分為兩局部，5’決定靶序列的20堿基(seedsequence)和3’區(qū)域為保守的構(gòu)造序列。因此構(gòu)建針對特定靶位點的sgRNA，只需要克隆決定靶序列的5’端20nt(seedsequence)。sgRNA用smallnuclear(sn)RNAU6/U3啟動子驅(qū)動，以保證轉(zhuǎn)錄出的sgRNA停留在細(xì)胞核中與Cas9結(jié)合。本方案用PCR擴(kuò)增的方法構(gòu)建包含靶序列的sgRNA表達(dá)盒，并在擴(kuò)增引物5’端引入順次排列的位置特異BsaI酶切位點，用于GoldenGate克隆?；蛟跀U(kuò)增引物5’端參加互補(bǔ)序列用于GibsonAssembly連接克隆。為了提高構(gòu)建好的多靶點載體的穩(wěn)定性，防止在農(nóng)桿菌或者植物基因組中sgRNA表達(dá)盒之間發(fā)生同源重組，從水稻克隆了4個不同snRNA啟動子(OsU3,OsU6a，OsU6b，OsU6c)，用于單子葉植物；從擬南芥中克隆了4個不同snRNA啟動子〔AtU3b，AtU3d，AtU6-1，AtU6-29〕，用于雙子葉植物。Figure3．(A)OverallstructureofeightbasicsgRNAintermediatevectors.(B)ThetwoBsaIcuttingsequencesaregivenintwelvesgRNAvectors(inalinearform),includingotherfourvectors(pYLsgRNA-OsU3/LacZ,pYLsgRNA-OsU6a/LacZ,pYLsgRNA-AtU3b/LacZ,andpYLsgRNA-AtU3d/LacZ)thathaveanadditionalLacZgene(198bp)asacloningselectionmarker.TheU3andU6promotersfromrice(Os)andArabidopsis(At)andthesgRNAsequenceareseparatedbythevectorbackbone,toavoidamplificationoftheuncutplasmidsbyPCRwithshorte*tensiontimeduringtheconstructionofsgRNAe*pressioncassettes.Cutting(smallarrows)withBsaIproducesdifferentnon-palindromicstickyendstothepromotersandanendtothesgRNAsequence.(C)Arepresentativeregulartargetandanirregulartarget,theirtargetadaptorsfortheOsU6apromoter,andthetranscribed5’sequencesareshown.Aligatedtarget-sgRNAe*pressioncassetteisamplifiedbynestedPCRusingprimersU-F/gR-RandPps/Pgs.PpsandPgsareposition-specificprimerswithBsaIsitesfortheGoldenGateligation(TableS1),orwithoverlappingendsforGibsonAssembly(TableS3).3.靶位點選擇和接頭設(shè)計3.1靶位點選擇建議對1個目的基因設(shè)計2個靶點(尤其只有一個靶基因)，以降低*靶點打靶不成功的風(fēng)險?？稍贠RF5’區(qū)和功能構(gòu)造域各設(shè)計1個靶點，使之任何1個靶點的突變都可以產(chǎn)生功能缺失，或2個靶點之間的序列被敲除。設(shè)計靶點的原則：目的基因的正鏈和負(fù)鏈靶點的打靶效率大致一樣，都可以設(shè)計靶點；Regulartargets&irregulartargets(見以下說明)有同等打靶效率；靶點的GC%盡量不要低于40%，靶點序列GC%偏高(50-75%)有較高的打靶效率。靶點(按5-N20NGG-3方向)不要有連續(xù)4個以上的T，以防RNAPolIII將其作為轉(zhuǎn)錄終止信號；雖然非特異打靶〔脫靶〕對植物基因打靶不是很重要的問題，但應(yīng)進(jìn)展靶點特異性分析：用靶點+NGG〔前后各加幾十堿基〕與基因組做blast(選Somewhatsimilarsequences〕，防止使用與同源序列差異少于5個堿基的靶點(在切點附近和PAM可有2個堿基差異就具有特異性)?？梢允褂迷诰€軟件CRISPR-P(./crispr/)做這個分析，但可使用的靶點序列不一定為Regulartargets(AN19NGG或GN19NGG)，見以下關(guān)于Regulartarget&irregulartarget說明。打算用一個靶序列敲除2個或以上的同源基因時，選擇同源基因中堿基完全一樣的區(qū)域為靶位點。把靶點序列連接到sgRNA序列的5’端[(20bptarget)GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT],利用在線軟件(/"q=mfold/RNA-Folding-Form2.3)做二級構(gòu)造分析。靶序列與sgRNA序列產(chǎn)生連續(xù)配對7bp〔注意：RNA可以產(chǎn)生U-G配對〕以上會抑制其與染色體DNA靶序列結(jié)合靶點，因此要防止使用連續(xù)配對7bp以上的靶序列。3.2靶點接頭設(shè)計U6/U3基因由III型RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄起始點是確定的堿基位置。例如，U6為G堿基，U3為A堿基。因此，由U6/U3啟動子驅(qū)動的sgRNA首堿基一定是G或者A。但是設(shè)計的靶序列的首堿基不一定剛好是G或者A，因此設(shè)計接頭引物時需分兩種情況考慮：〔1〕如果目標(biāo)區(qū)NGG(PAM)上游第20堿基是A〔用U3啟動子〕或G(用U6a~c啟動子〕，作為常規(guī)靶點(regulartarget)，將A/G下游19堿基可按下列圖所示合成接頭。常規(guī)靶點〔regulartarget〕接頭〔targetadaptor〕的形式注：接頭正向引物T*-F和反向引物T*-R命名是根據(jù)靶點在sgRNA表達(dá)盒的連接方向決定，不是基因方向決定，否則這些引物用于檢測陽性克隆時容易搞錯方向;另外注意設(shè)計引物〔尤其反向引物〕時的5’-3’方向。〔2〕如果NGG上游第20堿基不是A或G，作為非常規(guī)靶點(irregulartarget)，將20堿基為靶序列合成接頭的形式非常規(guī)靶點〔irregulartarget〕接頭的形式也就是說，所用啟動子的轉(zhuǎn)錄起始點與NGG上游第20堿基一樣的regular靶點就是合成19堿基+4堿基粘性末端(轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的靶點配對序列為A/G+19=20)；不一樣的irregular靶點就是合成20堿基+4堿基粘性末端。對使用擬南芥的AtU3/AtU6啟動子的靶點接頭也是同樣道理，但對接各啟動子的粘性末端不同〔見Figure3B〕。3.3OverlappingPCR法擴(kuò)增sgRNA表達(dá)盒引物設(shè)計見4.1.2〔與3.2一樣目的，自由選擇用任一個方案〕4.pYLCRISPR/Cas9打靶載體構(gòu)建原理4.1靶點引物接頭與sgRNA表達(dá)盒的連接和擴(kuò)增4.1.1sgRNA構(gòu)建方法1(接頭連接擴(kuò)增法，與3.2對應(yīng))：連接接頭后〔連接操作見步驟5-5〕，有3種方法擴(kuò)增sgRNA表達(dá)盒片段〔Figure4〕：〔1〕直接用GoldenGate位置特異引物(TableS1)做一輪PCR擴(kuò)增。此方案效果不則穩(wěn)定，且不能防止擴(kuò)增下列圖的產(chǎn)物IV和產(chǎn)物V?！?〕做2輪巢式PCR，第一輪PCR用通用的U-F/gR-R做1個反響〔引物序列見附錄〕，第二輪PCR用位置特異引物擴(kuò)增。此方案擴(kuò)增效果好且穩(wěn)定，但同樣不能防止擴(kuò)增產(chǎn)物IV和產(chǎn)物V〔注1〕?！?〕做2輪巢式PCR，第一輪PCR做2個反響，分別用U-F/接頭反向引物，和用接頭正向引物/gR-R；第二輪為OverlappingPCR,用位置特異引物擴(kuò)增出表達(dá)盒產(chǎn)物。雖然此方案第一輪PCR需要做2個反響，但效果最好且能防止擴(kuò)增產(chǎn)物IV和產(chǎn)物V，因此推薦使用此方法。Figure4．GenerationofasgRNAe*pressioncassettebyadaptor-ligationandPCRamplification在第一輪PCR加熱過程中〔73-75度〕，有缺口的引物〔Tm值低于U3/6和sgRNA序列〕先解離，U3/6和sgRNA序列3’端〔未解離〕立即延伸補(bǔ)平，產(chǎn)生接頭引物互補(bǔ)結(jié)合位點。注1:為了提高接頭連接效率，本操作中使用較高濃度〔0.05μM〕的靶點接頭，實際上大局部產(chǎn)生線性單端連接(產(chǎn)物II,III)，而環(huán)狀(雙端)連接(產(chǎn)物I)較少。另外，過度酶切，星活性，過度連接等都可能產(chǎn)生破壞的平滑末端，有可能連接產(chǎn)生雙接頭產(chǎn)物或的空載產(chǎn)物〔產(chǎn)物IV和產(chǎn)物V〕。sgRNA構(gòu)建方法2〔以O(shè)verlappingPCR往sgRNA表達(dá)盒導(dǎo)入靶序列〕這種方法不需要用BsaI切sgRNA質(zhì)粒和連接反響，更加簡便，不會產(chǎn)生上述的產(chǎn)物IV和V。即設(shè)計的2條靶點引物3’端有15-17nt分別與U3/U6啟動子和sgRNA配對，用PCR擴(kuò)增出片段后進(jìn)展第二輪overlappingPCR。Figure5.ProceduresforgenerationofasgRNAe*pressioncassettecontainingatargetsequencebyoverlappingPCR.ThechimericprimerswithtargetsequencestrandsaregiveninTableS2.ThefirstPCRcanbecarriedoutintwoseparatedreactionswithU-F/U*T*-andgRT*+/gR-Rprimerpair,respectively,orinonereactionwiththeall4primers.U*indicatesagivenpromoter,andT*+andT*-indicatestrandsofatargetsequence.4.4靶標(biāo)gRNA表達(dá)盒排列和擴(kuò)增引物使用方法本系統(tǒng)目前使用水稻來源的4個smallnuclearRNA啟動子的表達(dá)水平為OsU6a>OsU6b>OsU6c>OsU3a。但打靶成成效率好似與sgRNA的表達(dá)水平?jīng)]有明顯的相關(guān)性(即在水稻sgRNA水平不是限制性因素)。當(dāng)連接靶點多于4個時，為了降低一樣啟動子序列在農(nóng)桿菌發(fā)生同源重組的可能性，使一樣啟動子間的距離盡量近〔2個相鄰的同向重復(fù)序列間能夠發(fā)生同源配對的堿基對數(shù)少于該重復(fù)序列長度的1/2〕。因此建議U3、U6a~c啟動子的使用和排列方式為：1個靶點：LacZ-U6a2個靶點：LacZ-U6a—U6b3個靶點：LacZ-U6a—U6b—U6c4個靶點：LacZ-U6a—U6b—U6c—U35個靶點：LacZ-U6a—U6a—U6b—U6c—U36個靶點：LacZ-U6a—U6a—U6b—U6b—U6c—U37個靶點：LacZ-U6a—U6a—U6b—U6b—U6c—U6c—U38個靶點：LacZ-U6a—U6a—U6b—U6b—U6c—U6c—U3—U3注：由于靶點接頭5’端4個堿基形成的粘性末端是根據(jù)使用的不同啟動子而不同，要注意其對應(yīng)關(guān)系。sgRNA表達(dá)盒特定位置引物對的使用方法(T1，T2為靶序列；U*為各啟動子)：1cassette:Pps-GGL/Pgs-GGR;擴(kuò)增相應(yīng)的U*-T1-gRNA2cassettes:Pps-GGL/Pgs-GG2,Pps-GG2/Pgs-GGR;擴(kuò)增相應(yīng)的U*-T1-gRNA,U*-T2-gRNA;3cassettes:Pps-GGL/Pgs-GG2,Pps-GG2/Pgs-GG3,Pps-GG3/Pgs-GGR;擴(kuò)增相應(yīng)的U*-T1-gRNA,U*-T2-gRNA,U*-T3-gRNA;4cassettes:Pps-GGL/Pgs-GG2,Pps-GG2/Pgs-GG3,Pps-GG3/Pgs-GG4,Pps-GG4/Pgs-GGR;擴(kuò)增相應(yīng)的U*-T1-gRNA,U*-T2-gRNA,U*-T3-gRNA,U*-T4-gRNA5個或以上靶點：如此類推。4.5靶標(biāo)sgRNA表達(dá)盒與pYLCRISPR/Cas9載體的連接方法本載體系統(tǒng)可采用GoldenGatecloning(Engleretal.,2008;2009),Gibsonassembly方法(Gibson,etal.,2009,2010)2種策略組裝Cas9載體和多個gRNA表達(dá)盒片段。GoldenGateligation是利用BsaI(typeIIsrestrictionenzyme)的識別位點和切割位點不重疊的特性，可以設(shè)計出多種不同的且非回文構(gòu)造的粘性末端〔256-16=240種，減去的16種是回文構(gòu)造；第6-7頁的PCR擴(kuò)增引物使用了16種〕。多個要連接的片段在連接點具有特異的互補(bǔ)末端可以連接〔如圖6,4個表達(dá)盒為例)，而非連接點的末端之間不互補(bǔ)不能連接〔一樣末端分子間也不互補(bǔ)不能連接〕，因此連接反響是向著目標(biāo)單方向進(jìn)展，效率很高。由于OsU6a-LacZ(AtU3b-LacZ)附有LacZ標(biāo)記基因(198bp)，可在含有*-gal的培養(yǎng)基產(chǎn)生藍(lán)色菌斑篩選陽性克隆。Figure6.Generationofa4-targetconstructbyGoldenGatecloning注：由引物Pps-GGL導(dǎo)入載體的唯一SpeI位點是特別留的一個“后門〞。其用途是，在構(gòu)建好一組目的靶點sgRNA表達(dá)盒的載體的根底上，如果情況需要再添加第二組其它靶點sgRNA表達(dá)盒，可以用SpeI將載體切成線狀，再用GibsonAssembly將第二組靶點sgRNA表達(dá)盒克隆進(jìn)去。如果連接較多〔4個或以上〕的sgRNA表達(dá)盒的效率低〔轉(zhuǎn)化不能獲得陽性克隆〕，就以連接產(chǎn)物為模板，以引物PB-L/PB-R(見TableS1)擴(kuò)增出連接的多個表達(dá)盒，再次與pYLCRISPR/Cas9載體酶切連接。5.載體構(gòu)建操作方法：Figure7.Workingflowchartforpreparationofmulti-targetCRISPR/Cas9constructs〔1〕菌種活化和質(zhì)粒提取制備：將pYLCRISPR/Cas9菌種(TOP10F’)和CRISPR/sgRNAvectors菌種(DH10B)分別在含有卡那霉素〔25μg/ml〕和氨芐青霉素〔50μg/ml〕平板培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)過夜，挑取單菌落培養(yǎng)1ml種子液，再擴(kuò)大培養(yǎng)用于提取質(zhì)粒。用2-3UBsaI試切~150ng質(zhì)粒(10μl)，電泳檢查〔未切的80ng質(zhì)粒為對照〕。注：不要將保存的菌種直接接種！關(guān)鍵點：pYLCRISPR/Cas9載體較大〔約15~16.5kb〕，拷貝數(shù)較低〔pBR322復(fù)制子〕，用質(zhì)粒小型柱提取純化的回收率較低，因此最好用適合于較大質(zhì)粒提取的大柱純化試劑盒〔如TIANGEN公司EndoFreeMa*iPlasmidKit〕提取純化〔由于溶出的質(zhì)粒DNA可能含有殘留的洗液成分即乙醇，且體積大濃度低，最好再做一次標(biāo)準(zhǔn)的乙醇沉淀操作以去除殘留乙醇和減少DNA溶液體積〕，或用普通堿裂解法提取〔用酚/氯仿抽提2次后再乙醇沉淀〕。溶解在TE〔約0.5g/l〕保存。取局部質(zhì)粒稀釋成約100ng/l冷凍保存，作為步驟〔10〕使用。關(guān)鍵點：由于接下來要用到的BsaI是很容易失活的酶，有時新買的BsaI也是失活的！在進(jìn)展以下步驟之前，先檢測BsaI活性：配制10μlBsaI反響液，含有5UBsaI,~100ngpYLgRNA-U*(或其它有AmpR基因的質(zhì)粒)。37℃反響15min后電泳檢查，以未切的一樣質(zhì)粒為對照。pYLgRNA-U*的BsaI圖譜見Figure3。為了盡可能保持酶活性，最好把BsaI分裝成幾管冷凍保存。NEB公司的BsaI-HF經(jīng)過修飾以降低星活性，推薦使用NEBBsaI-HF和配套的CutSmartBuffer。sgRNA表達(dá)盒構(gòu)建方法1:〔2〕靶點接頭制備：將接頭引物TE溶解成100μM母液，各取1μl參加到98μl0.5*TE混合稀釋到1μM。約90℃30s，移至室溫冷卻完成退火?！?〕sgRNA載體酶切：取pYLgRNA-OsU3/LacZ等質(zhì)粒各1μg，在25μl反響用10UBsaI酶切20min，冷凍保存。關(guān)鍵點：不要用太多酶和太長時間過度酶切！〔4〕sgRNA表達(dá)盒連接反響：酶切過的pYLgRNA-OsU3/LacZ等質(zhì)粒與各所對應(yīng)接頭連接反響：成分參加量終濃度(量)10×T4DNAligaseBuffer1μl1×pYLsgRNA-U*質(zhì)粒0.5μl10~20ng接頭0.5μl0.05μMT4DNAligase(Takara)0.05μl~18UddH2O補(bǔ)足到10μl室溫〔20-28℃〕連接約10-15min關(guān)鍵點：過多DNAligase和過長時間連接會產(chǎn)生較多第6頁所述產(chǎn)物IV&V。注：不同公司的T4DNAligase單位的定義和標(biāo)定單位不同，如Takara的350U/μl，NEB的400U/μl，但絕對活性單位/μl都接近，即每10~15μl反響大致使用0.05~0.1μl酶。上述步驟〔3〕，〔4〕酶切和連接二步反響可用一步酶切-連接反響〔邊切邊連法〕替代：配制10μl1*BsaI酶切連接〔Restriction-ligation〕反響液：在1*BsaI-酶切Buffer中參加ATP至終濃度0.5~1.0mM〔此buffer對BsaI和ligase都有效〕，參加約10~20ngpYLgRNA-U*質(zhì)?！差A(yù)先配好20ng/μl保存〕，0.5μl接頭〔最終濃度0.05μM〕，3~5UBsaI，~15UT4DNAligase。如果實驗室沒有ATP，在1*切酶Buffer中參加0.5-1.0μl10*NEBT4DNAligasebuffer〔10*NEBT4DNAligasebuffer中含有10mMATP,但10*TakaraT4DNAligasebuffer中含有1.0mMATP，因此優(yōu)先用NEB的〕。注意：沒有加切酶buffer而單純加T4DNAligasebuffer缺少KCl或NaCl，不適合BsaI酶切！〕。用變溫循環(huán)儀〔或PCR儀〕循環(huán)反響5循環(huán)：37℃5min，20℃5min?！?〕第一輪擴(kuò)增：每個sgRNA表達(dá)盒分為2個PCR反響，各15μl反響體系：取0.5μl連接產(chǎn)物為模板，使用第6頁引物U-F/接頭反向引物〔反響1〕，和接頭正向引物/gR-R〔反響2〕，各0.2μM,適量高保真PCR酶。25-28循環(huán)：94℃10s，60℃15s，68℃20s。(任意)取4μl電泳檢查〔反響2產(chǎn)物長度約140bp，用2%瓊脂糖膠〕。如果擴(kuò)增產(chǎn)物較弱，也可以繼續(xù)第二輪PCR。注：雖然用第二輪PCR的位置特異引物直接從連接產(chǎn)物也可以擴(kuò)增出目標(biāo)產(chǎn)物，但用2輪PCR擴(kuò)增可以更穩(wěn)定地得到特異性目標(biāo)產(chǎn)物且能防止空載產(chǎn)物擴(kuò)增，見Figure4。關(guān)鍵點：最好使用KOD-Plus(TOYOBO)，保真度最高且性價比高，或KODF*。不要使用能在產(chǎn)物3’附加A堿基的DNA聚合酶，此A堿基使產(chǎn)物在第二輪PCR中不與互補(bǔ)鏈配對而不能延伸補(bǔ)平〕。〔6〕第二輪PCR：按附錄1通用引物所述，預(yù)先將位置特異引物對混合成10×工作液，每種1.5μM：引物組合1個靶點：PT1R；2個靶點：PT1，PT2R；3個靶點：PT1，PT2，PT3R;4個靶點：PT1，PT2，PT3，PT4R;5個靶點：PT1，PT2，PT3，PT4，PT5R;6個靶點：PT1，PT2，PT3，PT4，PT5，PT6R；7個靶點：PT1，PT2，PT3，PT4，PT5，PT6，PT7R；8個靶點：PT1，PT2，PT3，PT4，PT5，PT6，PT7，PT8R取第一輪PCR產(chǎn)物1μl用H2O稀釋10倍，各取1μl混合為模板。各表達(dá)盒20-50μlPCR(1個靶點50μl；2-3個靶點各30μl；4個或以上靶點各20μl)。參加1/10量每種引物組合工作液〔最終濃度0.15μM〕。使用適量KOD-Plus或其它高保真PCR酶。擴(kuò)增17-20循環(huán)(實際情況調(diào)整)：95℃10s，58℃15s，68℃20s。取2-3μl電泳檢查產(chǎn)物長度是否符合〔注1〕，并估計樣品的大致濃度。注1：各種啟動子gRNA表達(dá)盒的長度為〔括號為BsaI切后〕：單子葉表達(dá)盒PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度〔bp〕BsaI酶切后長長度〔bp〕雙子葉表達(dá)盒PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度〔bp〕BsaI酶切后長度〔bp〕LacZ-OsU6a-gRNA831801LacZ-AtU3d-gRNA486456OsU6a-gRNA629599AtU3d-gRNA284254OsU6b-gRNA515485LacZ-AtU3b-gRNA709679OsU6b-gRNA924894AtU3b-gRNA507477LacZ-OsU3-gRNA766736AtU6-1-gRNA487457OsU3-gRNA603573AtU6-29-gRNA502472〔7〕根據(jù)各樣品產(chǎn)物估算的量，把所有產(chǎn)物大致等量混合，酚抽提乙醇沉淀或用PCR產(chǎn)物純化kit純化。關(guān)鍵點：此步驟是為了除去DNA聚合酶，以防止下面步驟BsaI酶切產(chǎn)生的粘性末端被補(bǔ)平。sgRNA表達(dá)盒構(gòu)建方法2(OverlappingPCR):〔8〕取2-5ngpYLgRNA-OsU*質(zhì)粒為模板，在一個反響中使用4種引物：U-F和gRT*+各0.2μM，U*T*-和gRT*+〔TableS1〕各0.1μM。25-28循環(huán)：94℃10s，58℃15s，68℃20s。在擴(kuò)增過程中，開頭的假設(shè)干循環(huán)時U-F/U*T*-擴(kuò)出U*--T*序列，gR-R/gRT*+擴(kuò)出T*--sgRNA序列。后期的循環(huán)過overlappingPCR產(chǎn)生2個片段合并的sgRNA表達(dá)盒片段。(9)取第一輪PCR產(chǎn)物1μl用H2O稀釋10倍，取1μl為模板，按以上步驟〔6〕進(jìn)展第二輪PCR。組裝sgRNA表達(dá)盒到pYLCRISPR/Cas9載體(策略I,GoldenGatecloning)：酶切-連接反響試劑參加量〔μl〕終濃度10×CutSmartBuffer1.51×10mMATP1.51mMpYLCRISPR/Cas9質(zhì)粒60-80ng4-6ng/μlsgRNA表達(dá)盒混合物每表達(dá)盒10-15ngBsaI-HF10U0.1-0.2U/μlT4DNAligaseH2O35U最終15μl2-3U/μl注：每個靶點約10-15ng(如1個靶點約10ng、2個靶點共20-30ng、3個共約40-50ng、4個共約60-70ng、更多靶點時每個片段的量適當(dāng)增加〔最多15ng/片段〕。這樣載體與每種插入片段摩爾比=1:4-6。用變溫循環(huán)進(jìn)展酶切連接約10-15循環(huán):37℃5min；10℃5min，20℃5min；最后37℃5min。此方法簡便效率高，陽性克隆率高，推薦優(yōu)先使用。冷凍保存未用完的連接產(chǎn)物，有必要時做下一步擴(kuò)增用。注：也可以用常規(guī)的先切后連法〔供參考〕：取約2-3μgpYLCRISPR/Cas9-MH(B)在50μl〔30UBsaI〕酶切30min,用低熔點膠電泳回收酶切的質(zhì)粒片段〔去除ccdB片段〕〔不要用太多酶或太長時間過度酶切〕。用0.5*TE洗回收膠30分鐘，65℃3min熔解，在40℃參加Agarase〔1U/100μl膠，NEB)處理30分鐘后，分裝成每管40-60ng〔2-3μl〕冷凍保存公用〔一管做一次連接，以防止屢次凍融〕。在切好分裝〔步驟2〕的pYLCRISPR/Cas9(約60-80ng〕管中，參加已用BsaI酶切好的PCR產(chǎn)物〔每個靶點約10-15ng〕，在10μl連接反響〔加35U連接酶〕，16℃〔或最好用變溫循環(huán):10℃5min，20℃5min；10-15循環(huán)〕連接2-3h〔不要過長時間連接〕。連接效率低的補(bǔ)救方法：〔11〕如果連接較多〔4個或以上〕的sgRNA表達(dá)盒的效率低,即連接產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化后不能獲得陽性克隆，就用步驟〔10〕的0.2-0.5μl連接產(chǎn)物為模板(直接轉(zhuǎn)化得不到陽性克隆的連接產(chǎn)物也可以作為擴(kuò)增模板，因為很少的連接分子就足夠被擴(kuò)增了)，以TableS1的引物PB-L/PB-R擴(kuò)增〔40μl，用KODF*〕(如果使用舊說明書的位置特異引物，PB-L/PB-R要改為PB-Lo/PB-Ro(見TableS1說明)。為提高擴(kuò)增特異性，用熱啟動：先不加引物，在反響溫度到達(dá)80度以上時介入引物〔最終0.2μM〕。10循環(huán)：97°C10s;60°C20s;68°C3-5min(延伸時間按40s/1sgRNA或1min/1kb);再15循環(huán)〔循環(huán)數(shù)可調(diào)整〕：97°C10s;68°C3-5min。電泳回收目標(biāo)片段〔擴(kuò)增產(chǎn)物可能會有非特異小片段〕。取約20-30ng產(chǎn)物與50-60pYLCRISPR/Cas9按以上步驟〔10〕再酶切與連接。注：PB-L/PB-R位于雙元載體與sgRNA表達(dá)盒的連接點(Figure4)?！?2〕連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化〔電激法〕：將連接產(chǎn)物滴載在懸浮式透析膜MilliporeVSWP04700〔0.025μm孔徑〕對0.2*TE透析15~30min〔最好在4℃冷柜〕透析脫鹽〔注1〕。取1-1.5μl連接產(chǎn)物電激轉(zhuǎn)化E.coliDH10B感受態(tài)細(xì)胞〔注2〕，電激后參加1mlSOC，37℃培養(yǎng)1-1.5h。涂板培養(yǎng)基為LB+25μg/mlKan,0.3~0.5mMIPTG(注3)，適量*-gal。IPTG誘導(dǎo)沒有徹底切除ccdBs的空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子的ccdBs表達(dá)致死。而含有目標(biāo)插入序列〔LacZ-OsU3-gRNA表達(dá)盒〕的陽性克隆由LacZs表達(dá)產(chǎn)生藍(lán)色菌斑〔注4〕。注1：或用乙醇沉淀，70%乙醇洗，風(fēng)干溶在5μl去離子水。注2：化學(xué)熱激法轉(zhuǎn)化也可以獲得陽性克隆，但效率較低。因此，有電激儀的實驗室應(yīng)該使用電激法。雖然其它菌株也可以用，但DH10B更適合高效率電激轉(zhuǎn)化大質(zhì)粒。電激轉(zhuǎn)化感受體態(tài)細(xì)胞制備最好用SOB培養(yǎng)〔不要用LB培養(yǎng)〕，以10pgpUC18質(zhì)粒轉(zhuǎn)化測試轉(zhuǎn)化效率〔小質(zhì)粒用電激電壓1800V/20μl感受態(tài)細(xì)胞/1μl電激杯〕，要求到達(dá)效率>109colonies/1μgpUC18(即電激10pg質(zhì)粒，涂1/20轉(zhuǎn)化細(xì)胞出500以上菌斑)。>15kb大質(zhì)粒的電激電壓為1500-1600V/20μl感受態(tài)細(xì)胞/1μl電激杯〔或2500V/40μl感受態(tài)細(xì)胞/2μl電激杯〕；注3：使用LacIq基因型菌種用1.0mM注4：注意：白色且生長大小正常的菌斑是已切除ccdBs但末端破壞平端連接的空載克隆，或ccdBs功能突變〔有約1/1000頻率發(fā)生〕但未切除ccdB的空載克隆?！?3〕提取質(zhì)粒，MluI酶切電泳檢測sgRNA表達(dá)盒連接片段。如果MluI酶切帶型有疑問，用AscI酶切確認(rèn)?！踩绻鲆韵虏襟E測序，可不做這個PCR檢測〕取少量〔1~3ng〕質(zhì)粒為模板對所有靶點進(jìn)展PCR檢測(也用空載質(zhì)粒做陰性對照)。引物配對形式為：SP-DL引物與第一靶點接頭反向引物配對；第一靶點接頭正向引物與第二靶點反向接頭引物配對；第二靶點正向接頭引物與第三靶點接頭反向引物配對；第三靶點接頭正向引物與第四靶點反向接頭引物配對；…如此類推，最后靶點正向接頭引物與SP-R引物配對。這樣每個靶點的正反方向都檢測過一次。電泳確認(rèn)其大小是否符合預(yù)期?！?4〕測序檢測(如果步驟13確認(rèn)了，可以不做此測序)：利用各靶點引物的特異性，按下列圖方式對特定靶點進(jìn)展測序。Figure8.StrategyforsequencingofthelinkedsgRNAe*pressioncassettes注：最好提醒測序公司，這是中低拷貝的較大質(zhì)粒，以便公司采取相應(yīng)措施。注：由于OsU6c比擬長〔742bp〕，用前一個靶點正向引物不一定能測通OsU6c到靶序列〔T*〕，如果OsU6c是最后一個表達(dá)盒，要用SP-R(見第2頁)進(jìn)展測序；如果U6c不是最后一個表達(dá)盒，用其后面的靶點反向引物測。〔15〕導(dǎo)入農(nóng)桿菌。獲得的克隆電激轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌〔EHA105〕。在農(nóng)桿菌的穩(wěn)定性檢測〔可以不做〕：從農(nóng)桿菌提取質(zhì)?！厕r(nóng)桿菌提取質(zhì)粒質(zhì)量較差，只適合做PCR〕，取約2-5ng質(zhì)粒為模板再用所有靶點接頭正向引物和反向引物配對進(jìn)展PCR確認(rèn)。可選步驟：或?qū)①|(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH10B，再挑取單克隆培養(yǎng)，并提取質(zhì)粒酶切分析。(16)獲得的陽性農(nóng)桿菌可用于侵染植物組織。(17)獲得轉(zhuǎn)基因植株的打靶效果檢測：打靶成功的轉(zhuǎn)化體往往在靶點產(chǎn)生單堿基插入或者缺失假設(shè)干堿基。以T0植株靶點為中心，在兩側(cè)各離開約150-200bp處合成引物，PCR產(chǎn)物直接測序。如果出現(xiàn)單個堿基是雜合峰，可以判斷2個等位基因型；如果從*個堿基以后全部是重疊峰峰，說明是雜合突變或雙等位突變，可按Maetal.,2015(Mol.Plant2015,DOI:d*./10.1016/j.molp.2015.02.012)方法進(jìn)展解碼；如果測序峰圖無雜峰，而在靶點位置序列出現(xiàn)差異，可以判定為純合突變。注1：擬南芥T1代有相當(dāng)多嵌合突變和雜合突變，后代別離可能不符合孟德爾別離比，還會出現(xiàn)新的突變。附錄1本附錄列出了使用本載體系統(tǒng)所必需的局部材料。其它常規(guī)分子克隆需要的材料沒有列出。菌種：大腸桿菌Top10F’，用于pYLCRISPR/Cas9系列載體的繁殖，如果我們已經(jīng)提供了含有質(zhì)粒的菌種，則不需要準(zhǔn)備。大腸桿菌DH10B或DH5a或其他常用克隆用菌種，用于克隆載體；農(nóng)桿菌EHA105或者其他農(nóng)桿菌，用于轉(zhuǎn)化水稻，擬南芥等植物；酶：BsaI-HF(NEB,cat.no.R3535);MluI(TAKARA,cat.no.D1071);KODPlus(TOYOBO,cat.no.KOD-201);KODF*(TOYOBO,cat.no.KF*-101);GoldenGate克隆通用引物：TableS1.PrimersusedforGoldenGatecloningofsgRNAe*pressioncassettes.PositionPrimerSequence(5’--3’)1stPCRU-FCTCCGTTTTACCTGTGGAATCGgR-RCGGAGGAAAATTCCATCCAC2ndPCRSiteB-LSite2Pps-GGLTTCAGAggtctcTctcgACTAGTATGGAATCGGCAGCAAAGGPgs-GG2AGCGTGggtctcGtcagggTCCATCCACTCCAAGCTCSite2Site3Pps-GG2TTCAGAggtctcTctgacacTGGAATCGGCAGCAAAGGPgs-GG3AGCGTGggtctcGtcttcacTCCATCCACTCCAAGCTCSite3Site4Pps-GG3TTCAGAggtctcTaagacttTGGAATCGGCAGCAAAGGPgs-GG4AGCGTGggtctcGagtccttTCCATCCACTCCAAGCTCSite4Site5Pps-GG4TTCAGAggtctcTgactacaTGGAATCGGCAGCAAAGGPgs-GG5AGCGTGggtctcGgtccacaTCCATCCACTCCAAGCTCSite5Site6Pps-GG5TTCAGAggtctcTggactagTGGAATCGGCAGCAAAGGPgs-GG6AGCGTGggtctcGcagatagTCCATCCACTCCAAGCTCSite6Site7Pps-GG6TTCAGAggtctcTtctgcaaTGGAATCGGCAGCAAAGGPgs-GG7AGCGTGggtctcGacctcaaTCCATCCACTCCAAGCTCSite7Site8Pps-GG7TTCAGAggtctcTaggtttcTGGAATCGGCAGCAAAGGPgs-GG8AGCGTGggtctcGagcgttcTCCATCCACTCCAAGCTCSite8SiteB-RPps-GG8TTCAGAggtctcTcgctgatTGGAATCGGCAGCAAAGGPgs-GGRAGCGTGggtctcGaccgACGCGTATCCATCCACTCCAAGCTCFlankingPrimersPB-LPB-RGCGCGCgGTctcGCTCGACTAGTATGGGCGCGCggtctcTACCGACGCGTATCC〔1〕TheBsaI-cuttingnon-palindromicendswiththesamecolorarepatibleforligation.〔2〕ACTAGTandACGCGTareSpeIandMluIsites,respectively.〔3〕IfmoresgRNAe*pressioncassettesareneeded,newprimersetscanbedesignedwithdistinctBsaI-cleavingsites.〔4〕TableS1的位置特異引物與舊說明書的引物相比，改了引物名并有少量修改。舊說明書的引物可以繼續(xù)使用，但如果要PCR擴(kuò)增連接產(chǎn)物，PB-L/PB-R要改為：PB-Lo:GGCGCGCgGTctcGCTCGACTAGTG-3’；PB-Ro:GCGCGCggtctcTACCGACGCGTCCA-3’。TableS2.PrimersusedforintroductionoftargetsequencesintosgRNAe*pressioncassettesbyoverlappingPCR.PrimerSequencegRT*+(N19orN20)gttttagagctagaaat-3’OsU6aT*-(N19orN20)Cggcagccaagccagca-3’OsU6bT*-(N19orN20)Caacacaagcggcagc-3’OsU6cT*-OsU3T*-(N19orN20)Ctgagcctcagcgcag-3’(N19orN20)Tgccacggatcatctgc-3’AtU3bT*-(N19orN20)Tgaccaatgttgctcc-3’AtU3dT*-(N19orN20)Tgaccaatggtgctttg-3’AtU6-1T*-(N19orN20)Caatcactacttcgtct-3’AtU6-29T*-(N19orN20)Caatctcttagtcgact-3’Note:Forregulartargets,useN19(19nucleotides)asthetargetsequencesthatdonotincludethefirstbaseGorA;forirregulartargets,useN20(20nucleotides)asthetargetsequences.AllgRT*+primershavethesame3’endsequence(gttttagagctagaaat-3).策略II:基于GibsonAssembly的gRNA表達(dá)盒與pYLCRISPR/Cas9的連接方法Gibson等開發(fā)了一種“isothermalinvitrorebinationreaction〞，也稱為“GibsonAssembly〞可進(jìn)展多個PCR片段的連接(Gibson,etal.,2009;Gibson,etal.,2010;Gibson,2011)。商業(yè)的連接克隆試劑盒“GibsonAssemblyKit〞(NEB)就是基于此技術(shù),Takara的In-Fusion使用不同酶系，原理相似，也可以到達(dá)一樣目的，但這些試劑盒很昂貴！〔1500-1700元/10次反響〕。本實驗室利用自制的isothermalinvitrorebinationreactionmi*ture(見以下，本錢非常低)，可進(jìn)展質(zhì)粒載體的多個片段同時克隆和缺失〔Jiangetal.,2013.One-stepcloningofintron-containinghairpinRNAconstructsforRNAinterferenceviaisothermalinvitrorebinationsystem.Planta238,325-330;Zhuetal.,2014.Robustmulti-typeplasmidmodificationsbasedonisothermalinvitrorebination.Gene548,39–42〕。以下介紹基于GibsonAssembly的CRISPR/Cas9多靶點載體的構(gòu)建。Figure6.Generationofa4-targetconstructbyGibsonAssemblycloning根據(jù)在一個載體構(gòu)建靶點數(shù)的需要，合成以下引物對。以下一樣顏色表示連接配對序列，3’端黑色字母表示與U3/6啟動子上游配對序列(U-GA*)或與sgRNA下游配對(Pgs-GA*)序列，長框為各種通用引物配對位點〔標(biāo)注在右側(cè)〕，位于各表達(dá)盒的連接處，用于測序檢驗陽性克隆時，測序公司可以提供這些通用引物。TableS4.PrimersusedforGibsonAssemblyofsgRNAe*pressioncassettes.PositionPrimerSequence(5’--3’)1stPCRU-FCTCCGTTTTACCTGTGGAATCGgR-RCGGAGGAAAATTCCATCCAC2ndPCRSiteB-LSite2U-GALACCGGTAAGGCGCGCCGTAGTGCTCGACTAGTATGGAATCGGCAGCAAAGGPgs-GA2CAGGGAGCGGATAACAATTTCACACAGGCACATCCACTCCAAGCTCTTGPtacpromoterFprimersiteSite2Site3U-GA2GTGCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCCCTGGAATCGGCAGCAAAGGPgs-GA3CCACGCATACGATTTAGGTGACACTATAGCGCATCCACTCCAAGCTCTTGSp6promoterprimersiteSite3Site4U-GA3CGCTATAGTGTCACCTAAATCGTATGCGTGGTGGAATCGGCAGCAAAGGPgs-GA4GTCGCTAGTTATTGCTCAGCGGCCAAGCTCATCCACTCCAAGCTCTTGT7terminatorFprimersiteSite4Site5U-GA4GAGCTTGGCCGCTGAGCAATAACTAGCGACTGGAATCGGCAGCAAAGGPgs-GA5CATCGTCGCCGTCCAGCTCGACCATTGAACATCCACTCCAAGCTCTTGEGFP-NprimersiteSite5Site6U-GA5GTTCAATGGTCGAGCTGGACGGCGACGATGTGGAATCGGCAGCAAAGGPgs-GA6GCTCCGAATACGACTCACTATAGGGTGACCATCCACTCCAAGCTCTTGT7universalprimersiteSite6Site7U-GA6GGTCACCCTATAGTGAGTCGTATTCGGAGCTGGAATCGGCAGCAAAGGPgs-GA7CTGAGGTTAACCCTCACTAAAGGGAAGCTCCATCCACTCCAAGCTCTTGT3PromoterprimersiteSite7Site8U-GA7GGAGCTTCCCTTTAGTGAGGGTTAACCTCAGTGGAATCGGCAGCAAAGGPgs-GA8CGTGGTATGCTAGTTATTGCTCAGCCTCGACATCCACTCCAAGCTCTTGT7terminatorRprimersiteSite8SiteB-RU-GA8GTCGAGGCTGAGCAATAACTAGCATACCACGTGGAATCGGCAGCAAAGGPgs-GARTAGCTCGAGAGGCGCGCCAATGATACCGACGCGTATCCATCCACTCCAAGCTCTTGNote:OneormultiplesgRNAe*pressioncassettesareamplifiedwiththeprimerpairsinthisway:1cassette:Pps-GAL/Pgs-GAR;2cassettes:Pps-GAL/Pgs-GA2,Pps-GA2/Pgs-GAR;3cassettes:Pps-GAL/Pgs-GA2,Pps-GA2/Pgs-GA3,Pps-GA3/Pgs-GAR;4cassettes:Pps-GAL/Pgs-GA2,Pps-GA2/Pgs-GA3,Pps-GA3/Pgs-GA4,Pps-GG4/Pgs-GAR;andsoon.ThesameflankingprimersPB-LandPB-RshowninTableS1canbeusedtoamplify,ifnecessary,theligatedsgRNAe*pressioncassettes.注：為方便操作，參考11頁〔6〕模式預(yù)先混合好引物組?！?〕自制Isothermalinvitrorebinationreactionmi*ture：5*isothermal〔ISO〕reactionbuffer：25%PEG-8000，500mmol/LTris-HClpH7.5，50mmol/LMgCl2，50mmol/LDTT，4種dNTPs各1mmol/L，5mmol/LNAD，?20°C保存。2*mastermi*ture：200μL5×ISObuffer,T5E*onuclease(Epicentre)2.0units〔嚴(yán)格控制T5e*ouclease酶量，不能過少和過多！過多T5e*ouclease會造成DNA片段被快速降解〕，PhusionHigh-FidelityDNApolymerase(NEB)25units,Taqligase(NEB)2500units,deionizedwaterto0.5ml。多管分裝?20°C保存.〔3〕參考第8頁指引設(shè)計U3/6啟動子排列。但如果是4個靶點，建議把較長的U6c用于T3,U6b用于T4,這樣可以用SP2測通T4和T3?！?〕在50μl反響用20UBsaI酶切~2μgpYLCRISPR/Cas9約30min。取2μl〔~80ng〕電泳檢查，確認(rèn)被切出的ccdB條帶〔732bp〕。65℃5min失活，每管3μl〔~100ng〕約分裝冷凍保存〔一般不需要回收純化〕?！?〕按以上策略I步驟(2)至步驟(5)的第一輪PCR同樣操作；第二輪PCR使用以上TableS4引物對(各引物0.15μM)擴(kuò)增各靶點〔T1,T2,T3,...〕的gRNA表達(dá)盒片段。取2μl電泳檢查?！?〕根據(jù)各樣品產(chǎn)物估算的量，把所有產(chǎn)物大致等量混合，酚抽提乙醇沉淀或用PCR產(chǎn)物純化kit純化；或在PCR產(chǎn)物中參加單鏈核酸酶E*onucleaseI(E*oI,NEB)0.5μl(10units)在37°C處理10-15min消除剩余引物〔這是為了防止引物與目的片段競爭結(jié)合〕，80°C20min失活E*oI〔以防止消化Gibson反響中產(chǎn)生的單鏈末端〕，不需純化直接取適量進(jìn)入步驟7?！?〕在分裝有切好的pYLCRISPR/Cas9〔~100ng〕的管中參加適量的gRNA表達(dá)盒片段(每表達(dá)盒~15ng)，參加去離子水至最終量7~8μl。參加等量7~8μl2*mastermi*ture，50°C反響25~30min〔時間過長可能會造成DNA被T5e*ouclease降解！〕?？梢匀?0μl連接產(chǎn)物電泳檢查，正常反響可見連接的較大片段〔見18頁圖〕?！?〕參考策略I步驟(12)操作，但在透析膜對0.2*TE透析較短時間的5-10min〔這是因為ISObuffer含有PEG-8000，過長時間透析會吸收過多的0.2*TE降低連接產(chǎn)物濃度。但不透析直接電激轉(zhuǎn)化容易打炸或電激電流過大而降低轉(zhuǎn)化效率〕?！?〕陽性克隆PCR檢測按按策略I步驟(13)進(jìn)展；測序策略也可以用TableS4所示的通用引物〔測序公司可提供，將這些測序引物序列交測序公司確認(rèn)〕,從各表達(dá)盒連接點往sgRNA反向進(jìn)展測序。每個引物可以測通2個靶點。附錄2：載體構(gòu)建相關(guān)電泳圖〔以上為GoldenGate方法構(gòu)建〕A6-targetCRISPR/Cas9constructpreparedbyGibsonassemblyCharacterizationoftargetededitinginriceandArabidopsis.(A)EditingefficienciesofdifferentalleletypesdrivenbydifferentU3/U6promotersinriceT0plants.Figuresinparentheses(includingthoseinB,C,andF)arethenumbersofinvolvedtargetsandsequencedsite,respectively.(B)EditingefficienciesoftargetswithdifferentGCcontents.(C)Editingefficienciesoftheregularandirregulartargets.(D)Frequenciesofdifferenteditingevents,whichwerecalculatedfrom245mutatedsites(notincludingthoseofhomozygouswild-typeandfragmentaldeletionbetweentwotargetedsites).Subs,nucleotidesubstitution.(E)E*pectedandactualfrequenciesofhomozygousmutations.Thee*pectedfrequenciesofhomozygousmutations,calculatedbysquareofthefrequencyoftheeachmutationtypeshownin(D),wereassumedthattwoidenticalmutatedalleleswereproducedindependentlyatthebothhomologouschromosomalsitesbytheNHEJmechanism.Thedeletionmutationsofthreeandmorebaseswereomittedforthee*pectedfrequencycalculation.(F)EditingefficienciesofdifferentmutationtypesinArabidopsisT1plants.附錄3：載體序列GenBankdatalibraryunderaccessionnumbers:KR029097,KR029098,KR029099,KR0290100,KR0290101,KR0290102,KR0290103,KR0290104,KR0290105,KR0290106,KR0290107,KR029108fortheCRISPR/sgRNAintermediateplasmids,andKR0290109,KR0290110,KR0290111,KR0290112,KR0290113fortheCRISPR/Cas9binaryvectors.PCRproductofLacZ-U6a-sgRNA(831bp,801bpafterBsaIdigestion)TTCAGAGGTCTCTNNNNNNNTGGAATCGGCAGCAAAGGACGCGTTGACATTGTAGGACTATATTGCTCTAATAAAGGAGGCAGCTatgctggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggctaaTTTTTTCCTGTAGTTTTCCCACAACCATTTTTTACCATCCGAATGATAGGATAGGAAAAATATCCAAGTGAACAGTATTCCTATAAAATTCCCGTAAAAAGCCTGCAATCCGAATGAGCCCTGAAGTCTGAACTAGCCGGTCACCTGTACAGGCTATCGAGATGCCATACAAGAGACGGTAGTAGGAACTAGGAAGACGATGGTTGATTCGTCAGGCGAAATCGTCGTCCTGCAGTCGCATCTATGGGCCTGGACGGAATAGGGGAAAAAGTTGGCCGGATAGGAGGGAAAGGCCCAGGTGCTTACGTGCGAGGTAGGCCTGGGCTCTCAGCACTTCGATTCGTTGGCACCGGGGTAGGATGCAATAGAGAGCAACGTTTAGTACCACCTCGCTTAGCTAGAGCAAACTGGACTGCCTTATATGCGCGGGTGCTGGCTTGGCTGCCG(19-20bptarget)GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTCAAGAGCTTGGAGTGGATGGNNNNNNNCGAGACCCACGCTPCRproductofOsU6a-sgRNA(629bp,599bpafterBsaIdigestion)TTCAGAGGTCTCTNNNNNNNTGGAATCGGCAGCAAAGGATTTTTTCCTGTAGTTTTCCCACAACCATTTTTTACCATCCGAATGATAGGATAGGAAAAATATCCAAGTGAACAGTATTCCTATAAAATTCCCGTAAAAAGCCTGCAATCCGAATGAGCCCTGAAGTCTGAACTAGCCGGTCACCTGTACAGGCTATCGAGATGCCATACAAGAGACGGTAGTAGGAACTAGGAAGACGATGGTTGATTCGTCAGGCGAAATCGTCGTCCTGCAGTCGCATCTATGGGCCTGGACGGAATAGGGGAAAAAGTTGGCCGGATAGGAGGGAAAGGCCCAGGTGCTTACGTGCGAGGTAGGCCTGGGCTCTCAGCACTTCGATTCGTTGGCACCGGGGTAGGATGCAATAGAGAGCAACGTTTAGTACCACCTCGCTTAGCTAGAGCAAACTGGACTGCCTTATATGCGCGGGTGCTGGCTTGGCTGCCG(19-20bptarget)GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTCAAGAGCTTGGAGTGGATGGNNNNNNNCGAGACCCACGCTPCRproductofOsU6b-sgRNA(515bp,485bpafterBsaIdigestion)TTCAGAGGTCTCTNNNNNNNTGGAATCGGCAGCAAAGGATGCAAGAACGAACTAAGCCGGACAAAAAAAAAAGGAGCACATATACAAACCGGTTTTATTCATGAATGGTCACGATGGATGATGGGGCTCAGACTTGAGCTACGAGGCCGCAGGCGAGAGAAGCCTAGTGTGCTCTCTGCTTGTTTGGGCCGTAACGGAGGATACGGCCGACGAGCGTGTACTACCGCGCGGGATGCCGCTGGGCGCTGCGGGGGCCGTTGGATGGGGATCGGTGGGTCGCGGGAGCGTTGAGGGGAGACAGGTTTAGTACCACCTCGCCTACCGAACAATGAAGAACCCACCTTATAACCCCGCGCGCTGCCGCTTGTGTTG(19-20bptarget)GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTCAAGAGCTTGGAGTGGATGGNNNNNNNCGAGACCCACGCTPCRproductofOsU6c-gRNA(924bp,894bpafterBsaIdigestion)TTCAGAGGTCTCTNNNNNNNTGGAATCGGCAGCAAAGGActcattagcggtatgcatgttggtagaagtcggagatgtaaataattttcattatataaaaaaggtacttcgagaaaaataaatgcatacgaattaattctttttatgttttttaaaccaagtatatagaatttattgatggttaaaatttcaaaaatatgacgagagaaaggttaaacgtacggcatatacttctgaacagagagggaatatggggtttttgttgctcccaacaattcttaagcacgtaaaggaaaaaagcacattatccacattgtacttccagagatatgtacagcattacgtaggtacgttttctttttcttcccggagagatgatacaataatcatgtaaacccagaatttaaaaaatattctttactataaaaattttaattagggaacgtattattttttacatgacaccttttgagaaagagggacttgtaatatgggacaaatgaacaatttctaagaaatgggcatatgactctcagtacaatggaccaaattccctccagtcggcccagcaatacaaagggaaagaaatgagggggcccacaggccacggcccacttttctccgtggtggggagatccagctagaggtccggcccacaagtggcccttgccccgtgggacggtgggattgcagagcgcgtgggcggaaacaacagtttagtaccacctcgctcacgcaacgacgcgaccacttgcttataagctgctgcgctgaggctcaG(19-20bptarget)GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTCAAGAGCTTGGAGTGGATGGNNNNNNNCGAGACCCACGCTLacZ-OsU3-sgRNAstructureintheplasmidPCRproductofLacZ-OsU3-sgRNA(766bp,736bpafterBsaIdigestion)TTCAGAGGTCTCTNNNNNNNTGGAATCGGCAGCAAAGGACGCGTTGACATTGTAGGACTATATTGCTCTAATAAAGGAGGCAGCTATGctggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcTAAAGGAATCTTTAAACATACGAACAGATCACTTAAAGTTCTTCTGAAGCAACTTAAAGTTATCAGGCATGCATGGATCTTGGAGGAATCAGATGTGCAGTCAGGGACCATAGCACAAGACAGGCGTCTTCTACTGGTGCTACCAGCAAATGCTGGAAGCCGGGAACACTGGGTACGTTGGAAACCACGTGTGATGTGAAGGAGTAAGATAAACTGTAGGAGAAAAGCATTTCGTAGTGGGCCATGAAGCCTTTCAGGACATGTATTGCAGTATGGGCCGGCCCATTACGCAATTGGACGACAACAAAGACTAGTATTAGTACCACCTCGGCTATCCACATAGATCAAAGCTGGTTTAAAAGAGTTGTGCAGATGATCCGTGGCA(19-20target〕GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAAC