hplc-dad-elsd法同時測定復方瓜子金顆粒中秦皮乙素、蒙花苷和polygalesaponinxxi的含量

hplc-dad-elsd法同時測定復方瓜子金顆粒中秦皮乙素、蒙花苷和polygalesaponinxxi的含量

瓜子金屬、苦艾酒和海金沙、蛇舌草和紫花地黃的提取物包括6種藥物，具有清熱、利咽、止瀉、止咳、止咳等功效。用于慢性咽炎和其他呼吸道感染。復方體現(xiàn)的是整體協(xié)同作用,方中瓜子金為主藥,其皂苷類成分是發(fā)揮抗炎活性的主要成分;蒙花苷又名野菊花黃酮苷,對金黃色葡萄球菌和乙型溶血鏈球菌具有一定的抑制作用,是野菊花藥材的指標性成分,也是復方中的含量較高的成分;紫花地丁中主要含香豆素類成分,其中秦皮乙素具有明顯的抗炎作用。因此,研究這幾個化合物的檢測方法對于全面控制復方瓜子金顆粒的質量有著重要的意義。由于秦皮乙素和蒙花苷有很強的紫外吸收,故檢測的主要方法是HPLC-UV法,而瓜子金皂苷只有弱的末端吸收,HPLC-ELSD法是測定其含量的有效方法。目前,2005年版中國藥典中對于復方瓜子金顆粒質量控制的含量測定部分,主要是應用HPLC-UV法對方中紫花地丁的秦皮乙素進行控制,使用HPLC-DAD-ELSD法對復方瓜子金顆粒中秦皮乙素、蒙花苷和polygalasaponinXXI的同時測定尚未見文獻報道。本文將HPLC-DAD-ELSD聯(lián)用技術用于復方瓜子金顆粒中秦皮乙素、蒙花苷和polygalasaponinXXI的同時測定,其中秦皮乙素和蒙花苷采用HPLC-DAD法測定、polygalasaponinXXI采用HPLC-ELSD法測定。1標準1:dkma法高效液相色譜儀:Waters600泵,Waters996二極管陣列檢測器,Alltech2000ES蒸發(fā)光散射檢測器,Millennium32工作站;色譜柱:DiamonsilC18(250mrn×4.6mm,5μm)。乙腈:DikmaPure,DimaTechnologyINC,美國;甲醇:色譜純,江蘇漢邦科技有限公司;水:樂百氏純凈水;三氟醋酸:分析純,國藥集團化學試劑有限公司,其他試劑均為分析純。秦皮乙素對照品,購自中國藥品生物制品檢定所,批號741-200105,純度>98.0%;蒙花苷對照品,自制,經(jīng)核磁和質譜鑒定,HPLC面積歸一法測定,純度>98.0%;polygalasaponinXXI對照品,自制,經(jīng)核磁和質譜鑒定,HPLC面積歸一法測定,純度>98.0%。復方瓜子金顆粒為市售藥品,規(guī)格分別為5,10,20g·袋-1。2方法和結果2.1溶液制備2.1.1單一對照品溶液取對照品適量,精密稱定,加入甲醇溶解制成950μg·mL-1秦皮乙素、402μg·mL-1蒙花苷和628μg·mL-1polygalasaponinXXI的單一對照品儲備液。其他不同質量濃度的對照品溶液由儲備液稀釋混合得到。2.1.2濾膜濾膜制備復方瓜子金顆粒研細后取5g,精密稱定,置磨口三角瓶中,加入甲醇25mL后稱重,于80℃回流6h后,放冷,再稱重,甲醇補重,搖勻后經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液備用。2.1.3陰性樣品溶液的制備按處方比例制備不含瓜子金、野菊花和紫花地丁的陰性樣品,依“2.1.2”項下方法操作,得缺瓜子金、野菊花和紫花地丁的陰性樣品溶液,備用。2.2瓜子金顆粒、濕地松的色譜條件色譜柱:DiamonsilC18柱(250mm×4.6mm,5μm);流動相:乙腈(A)-0.05%三氟醋酸水溶液(B),梯度程序為0～10min(15%A),10～30min(15%A→28%A),30～40min(28%A),40～50min(28%A→32%A);流速:1.0mL·min-1;柱溫:30℃;進樣量:20μL;DAD檢測波長:340nm;ELSD參數(shù):漂移管溫度105℃,載氣流速2.6L·min-1。在上述色譜條件下進樣分析,理論塔板數(shù)按秦皮乙素、蒙花苷和polygalasaponinXXI色譜峰計算分別不低于4000,4000,2000;3個成分色譜峰與其相鄰色譜峰之間分離度均大于1.5,拖尾因子均在0.95～1.05之間。測得對照品、瓜子金顆粒樣品和陰性樣品色譜見圖1。結果表明陰性樣品色譜中,在與秦皮乙素、蒙花苷和polygalasaponinXXI相同的保留時間處均無吸收峰。A=5.683×104C+8.407×103r=0.9998A=2.730×104C+6.225×103r=0.9999lnA=1.663lnC+5.852r=0.9993線性范圍分別為4.75～118,75μg·mL-1,4.02～100.50μg·mL-1,19.62～157.00μg·mL-1。2.4rsd測定取中間濃度的混合對照品溶液,在上述色譜條件下重復進樣6次,記錄秦皮乙素、蒙花苷和polygalasaponinXXI的峰面積,計算RSD(n=6)分別為1.5%,1.4%,1.6%。2.5秦皮乙素、蒙花苷、polygalusaponinxi的平均含量取同一批復方瓜子金顆粒5g共6份,精密稱定,依“2.1.2”項下方法操作,在上述色譜條件下分析測定。秦皮乙素、蒙花苷和polygalasaponinXXI的平均含量(n=6)分別為0.162,0.135,0.142mg·g-1;RSD分別為1.9%,1.2%,2.7%。2.7標準曲線及峰面積的測定取復方瓜子金顆粒粉末5g,精密稱定,按“2.1.2”項下方法操作,得供試品溶液,在室溫下放置。在上述色譜條件下,分別于0,4,8,12,24,48h測定。計算秦皮乙素、蒙花苷和polygalasaponinXXI色譜峰面積的RSD分別為2.3%,1.5%,2.8%。結果表明,供試品溶液在48h內穩(wěn)定。2.8供試品溶液測定取不同批次的復方瓜子金顆粒樣品粉末5g,共10批,精密稱定,按“2.1.2”項下方法操作,得供試品溶液,分別在上述色譜條件下進行分析測定,外標兩點法計算含量,結果見表1。3討論3.1流動相系統(tǒng)洗脫曾考察過甲醇-酸水溶液、乙腈-酸水溶液等不同的流動相系統(tǒng),當以乙腈-三氟醋酸水溶液為流動相系統(tǒng)時峰形好;由于所測3個組分極性相差較大,故采用梯度洗脫。對乙腈—0.05%三氟醋酸水溶液體系多次考察結果顯示,在文中所述的梯度洗脫程序下,復方瓜子金顆粒樣品中秦皮乙素、蒙花苷和polygalasaponinXXI的分離效果最佳。3.2elsd參數(shù)的確定實驗中采用二極管陣列檢測器對秦皮乙素、蒙花苷和polygalasaponinXXI對照品溶液在190～400nm波長范圍內進行了紫外吸收掃描,得到秦皮乙素、蒙花苷的最大吸收波長分別為345和334nm,故選擇了340nm作為兩者的檢測波長。而對于相同濃度的polygalasaponinXXI,在ELSD上的響應遠大于在DAD最大吸收波長處的響應,相反,相同濃度的秦皮乙素和蒙花苷在ELSD上的響應遠小于在DAD上的響應。因此,在本試驗中,polygalasaponinXXI采用HPLC-ELSD法測定,而秦皮乙素和蒙花苷則采用HPLC-DAD法測定。在ELSD參數(shù)的選擇時,我們在推薦的參數(shù)(108.3℃,3.0L·min-1)基礎上進行了優(yōu)化。實驗中曾評價了漂移管溫度90～110℃和載氣流速從2.2～3.0L·min-1時polygalasaponinXXI的響應值,結果顯示最合適的漂移管溫度是105℃。一般來說,載氣流速越低,響應越強,但在實驗中發(fā)現(xiàn),當載氣流速降至2.4L·min-1時基線噪音較大,故最終選擇了2.6L·min-1。蒸發(fā)光散射檢測器的參數(shù)定為漂移管溫度105℃、載氣流速2.6L·min-1,在實驗中應嚴格控制這2個參數(shù),對于分析方法的重復性和準確性很重要。3.3polygalusaponinxi試驗復方瓜子金顆粒療效確切,已被列為國家中藥保護品種,2005年版中國藥典中規(guī)定通過測定其中的秦皮乙素含量來控制質量。而對于復方中的主藥瓜子金、野菊花等目前尚未建立有效的質量控制方法。本實驗首次建立了采用HPLC-DAD-ELSD聯(lián)用技術同時測定復方瓜子金顆粒中秦皮乙素、蒙花苷和polygalasaponinXXI含量的分析方法,其中蒙花苷和polygalasaponinXXI分別來源于方中的主藥瓜子金和野菊花。與單獨采用HPLC-DAD或HPLC-ELSD的方法相比較,本方法具有可同時靈敏、準確地測定復方瓜子金顆粒中的秦皮乙素、蒙花苷和polygalasaponinXXI的優(yōu)點,對于有效控制復方瓜子金顆粒的質量提供了可靠的評價方法。取上述對照品儲備液,用甲醇稀釋,配成秦皮乙素質量濃度分別為118.75,59.38,23.75,11.87,4.75μg·mL—1;蒙花苷質量濃度分別為100.5,50.25,20.1,10.05,4.02μg·mL-1;polygalasaponinXXI質量濃度分別為157.0,78.5,39.25,26.17,19.62μg·mL-1的混合對照品溶液。分別精密吸取此系列混合對照品溶液在上述色譜條件下進行分析。對于秦皮乙素和蒙花苷,以對照品溶液濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標,繪制標準曲線并進行回歸分析。對于polygalasaponinXXI,分別取對照品溶液濃度的自然對數(shù)和峰面積的自然對數(shù)為橫坐標和縱坐標,繪制標準曲線并進行回歸分析。結果秦皮乙素、蒙花苷和polygalasaponinXXl的回歸方程分別為:2.3線性關系研究2.6計算回收率和rsd取已知含量的復方瓜子金顆粒(批號:JS-050216)粉末9份,每份2.5g,精密稱定,3份為一組,每組分別加入低(80%)、中(100%)、高(120%)3個濃度的對照品溶液,按“2.1.2”項下方法制備溶液,在上述色譜條件下分析測定。計算回收率和RSD。秦皮乙素低、中、高濃度的回收率(n=3)分別為102.7%(RSD=2.6%),103.0%(RSD=1.3%),102.5%(RSD=