飼用酸性蛋白酶高產(chǎn)菌株選育及應(yīng)用研究

酸性蛋白酶高產(chǎn)菌株選育及應(yīng)用爭論一、概述20230424240040。酶是生物細胞原生質(zhì)合成且具有高度催化活性的蛋白質(zhì)。人類早造奶酪等已經(jīng)有幾千年的歷史。1897年Büchner覺察和分別提純，留意到了某些酶的作用需要有低分子物質(zhì)〔輔酶〕1926年Sumner20050通風(fēng)攪拌發(fā)酵技術(shù)的利用，使微生物酶制劑工業(yè)得到快速進展。2040α-淀粉酶的液體深層發(fā)酵首先在日本實現(xiàn)了2050術(shù)產(chǎn)業(yè)。由于酶制劑是一種綠色高效生物催化劑，具有高效、節(jié)能、安全和環(huán)保等特點，對酶制劑應(yīng)用產(chǎn)業(yè)開發(fā)產(chǎn)品、提高質(zhì)量、節(jié)能度重視，有著寬闊的進展前景。9％的增長速度，2023160胞外酶的微生物，如芽孢桿菌、大腸桿菌、放線菌、毛霉、黑曲霉、α-淀粉酶、β-淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、果膠酶、凝乳酶、脂肪酶DNAT4DNAa-乙酰乳酸脫羧酶、乳酸脫氫酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、延胡索酸酶、青霉素?；?、溶菌酶、鏈激酶、漆酶、植酸酶、復(fù)合酶等等。應(yīng)用范圍掩蓋洗滌劑、紡織、酒精、白酒、啤酒、味精、有機酸、淀粉糖、制藥、制革、飼料、造紙、果汁、肉、蛋、豆、奶、面制品加工等諸多領(lǐng)域，1965196510202321920％以上的速度增長，產(chǎn)值達6劑工業(yè)與興盛國家相比，存在的差距主要有：〔1〕技術(shù)爭論與開發(fā)分散，科研技術(shù)轉(zhuǎn)化力氣不強。〔2〕行業(yè)規(guī)模小而分散，市場調(diào)控100一還多，但銷售額僅占世界酶制劑銷售額5％，企業(yè)規(guī)模小、產(chǎn)品的〔3〕產(chǎn)品構(gòu)造不合理，技術(shù)落后。我國酶制劑產(chǎn)品主要是以糖化酶、淀粉97％，全國一半以上企業(yè)生產(chǎn)品種單一，抗市場風(fēng)險格外弱?！?〕酶制劑的應(yīng)用開發(fā)力度不夠，制約了酶制劑企業(yè)的市場開拓力氣。酸性蛋白酶是一類最適pH2.5-5.030000—40000。酸性蛋白酶主要來源于動物的臟器和微生物分泌物，包括胃蛋白酶、凝乳酶和一些微生物蛋白酶。依據(jù)其白酶相像，主要產(chǎn)酶微生物是曲霉、青霉和根霉等；另一類是與凝乳性，因此被廣泛地應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、輕工、皮革工藝以及飼料加工工業(yè)中。20為止，已覺察不少微生物可以產(chǎn)生酸性蛋白酶，如黑曲霉〔Aspergillusniger、大孢子黑曲霉突變株〔A.nigervar.macrosporu、齋藤曲霉A.saito、宇佐美曲霉A.usami泡盛酒曲霉〔A.awamori、微紫青霉〔Pen.janthinellu、常規(guī)青霉〔Pen.frequentens、杜邦青霉〔Pen.dupoti、宛氏擬青霉〔Paecilomycesvarioti、小孢米曲霉突變株〔A.oryzacvar.microsporu、根霉〔Rhizopussp.、微小毛霉〔M.pusillu、粘紅酵母Rhdotorulaglutini、粟疫霉EndothiaparasiticTrametessanguinc〔Cladosporium等。1903年，德國科學(xué)家從動物的胰臟中提取出胰蛋白酶，并將其用于皮革的柔制。1911年美國科學(xué)家從木瓜中提取木瓜蛋白酶，并1954蛋白酶進展了廣泛的爭論。1964年國外科學(xué)家覺察大孢子黑曲霉突變體能產(chǎn)生兩種不同的酸性蛋白酶。1965年又從血紅色陀螺孔菌產(chǎn)酸性蛋白酶，并對該酶進展了純化和結(jié)晶。1968年從微小毛霉發(fā)酵物中篩選出一種酸性蛋白酶，并對其進展了純化和酶學(xué)性質(zhì)分析。1995年國外科學(xué)家對煙曲霉酸性蛋白酶的基因進展了克隆和測序。2023年又從假絲酵母中篩選出一種酸性蛋白酶菌株，并對該酶進展酶的構(gòu)造和功能等已經(jīng)進展了廣泛系統(tǒng)的爭論。年上海工業(yè)微生物爭論所首先從黑曲霉篩選一株3．350產(chǎn)酸性蛋白酶菌3．350酸性蛋白酶菌種發(fā)1977年中國科學(xué)院微生物爭論所和疆生物土壤沙漠爭論所共同研制的由宇佐美曲霉經(jīng)誘變、篩選的537〔1994年〕用60Coγ射線誘變處理黑曲霉CPu菌株，獲得突變菌株6042，產(chǎn)酶活力比動身菌株提高近4倍。章劍林等〔1995年〕以黑曲霉為動身S3-1p值為2.50℃90℃下恒溫4h的酶活比動身菌株高64.2%。黃遵錫等(1999年)以黑曲霉YM3019A-1-倍。李永泉等1999年，對〔2023年〕對青霉產(chǎn)酸性蛋白酶的適宜條件和酶學(xué)性質(zhì)進展了分析?！?023〕承受硫酸銨鹽析法和離子交換層析法分別純化了黑曲霉產(chǎn)酸性蛋白酶，并對其氨基酸組分進展了分析。王云〔2023年〕通過質(zhì)譜指紋法對黑曲霉發(fā)酵液中所產(chǎn)蛋白進展了分析比對和鑒定酸性蛋白酶分子生物學(xué)方面的爭論。國內(nèi)生產(chǎn)酸性蛋白酶的廠家，根本上都是用537酸性蛋白酶菌種生產(chǎn)。早期生產(chǎn)的微生物酸性蛋白酶，只是工業(yè)級的，主要用于皮毛軟化。微生物菌種通過液體通風(fēng)發(fā)酵，成熟發(fā)酵醪再經(jīng)硫酸銨鹽析、板框壓濾、氣流〔沸騰〕枯燥、粉碎、化驗、包裝制成工業(yè)級酸性蛋壓濾機壓濾，濾清液經(jīng)超濾膜濃縮器濃縮經(jīng)化驗合格，參與防腐劑、穩(wěn)定劑就是成品的濃縮酸性蛋白酶制劑。1、酸性蛋白酶的作用機理酸性蛋白酶是一種天冬氨基蛋白酶，分子質(zhì)量為30~40KD,在其與動物消化道生理條件相適應(yīng)，而通常豬和家禽消化道內(nèi)溫度為40℃左右，而胃pH1.5—3.5，小腸pH5—7，與酸性蛋白酶作用的一發(fā)育不健全而在生長的中后期，自身雖有內(nèi)源酶，但尚顯缺乏，當承受全，特別是胃酸分泌缺乏，免疫功能低下，加上斷奶時的生理、養(yǎng)分率，導(dǎo)致早期生長受阻。假設(shè)在飼料中添加酸性蛋白酶，則能補充內(nèi)源酶的缺乏，使高分子的蛋白質(zhì)降解為低分子的肽、胨及各種氨基酸，應(yīng)激反響，削減養(yǎng)分障礙，提高飼料利用率，促進生長。2、酸性蛋白酶的酶學(xué)特性分泌的酸性蛋白酶雖具有一些共同的性質(zhì)，但在底物pH值、特異性、抑制劑、激活劑等方面均存在著確定的差異。(1)pH對酶活及酶穩(wěn)定性的影響酸性蛋白酶在pH2.0～6.0之間較為穩(wěn)定，但不同的微生物所產(chǎn)酶的最適作用有所不同。曲霉屬酸性蛋白酶最適作用pH值為2．5～4．0，穩(wěn)定pH值為1.5～6.0。齋藤曲霉所產(chǎn)酸性蛋白酶最適作用pH值為2．0～3．0，穩(wěn)定pH值為1.5～6.0。米曲霉所產(chǎn)酸性蛋白酶最適作用pH值為3．0～4．0，穩(wěn)定pH值為3.0～6.0。宇佐美曲霉所產(chǎn)酸性蛋白酶最適作用pH值為2．0～3．0，穩(wěn)定pH值為1.5～6.5。酸性蛋白酶對pH值的要求，與酶活性中心的羧基有關(guān)。〔2〕溫度對酶活性及穩(wěn)定性影響酸性蛋白酶一般在50℃以下較為穩(wěn)定，但也隨產(chǎn)酶微生物的不30℃下只能保持30分鐘，而曲霉屬的齋藤曲霉所產(chǎn)酸性蛋白酶在50℃穩(wěn)定，55℃處理10分鐘才會失活。黑曲霉Vs、V315菌株所產(chǎn)酸性蛋白酶在80℃保溫2小時后仍有90pH值條件下，50℃時到達最大酶活。酵母菌所產(chǎn)酸性蛋白酶經(jīng)60℃處理后還剩少許酶活力，經(jīng)70℃處理后酶活完全喪失。〔3〕金屬離子對酶活力的影響Ag＋對酸性蛋白酶有輕度抑制作用，當其濃度為5mol/L時，酶15%;Cu2Mn2Cu20.02mol/L時，對酶有明顯的激活作用；Cu2＋、Mn2＋和Al3＋同時1倍；Ca2＋本身并不抑制酸性產(chǎn)生抑制作用。液體酸性蛋白酶，長時間存放碳鋼罐中失活較多?！?〕抑制劑對酶活力的影響蛋白酶抑制劑—對-溴苯的抑制，但卻對N-溴代琥珀酰亞胺和高錳酸胃蛋白酶抑制劑(S-PI)抑制,這可能與酶的活性部位含酪氨酸以及色氨酸有關(guān)?！睞spergillusnigeY06〕的選育爭論1、材料和方法試驗材料動身菌株黑曲霉Aspergillusnige〕，CICC編號：3.43091.1.2培育基1.1.1.2.1分別及斜面培育基斜面培育基為PDA培育基和察氏培育基,分別培育基是在察氏PDA200g切成小塊，加水煮爛〔煮沸20~30〕用四層紗布過濾，加葡萄糖20克，瓊脂15-20克，連續(xù)加熱攪拌混勻，稍冷卻后再補足水分至1000PH，分裝試管，℃〕20后貯存?zhèn)溆谩２焓吓嘤合跛徕c3g、磷酸氫二鉀1g、硫酸鎂20g、蒸餾水1000mL，加熱溶解，自然PH121滅菌20min。1.1.2.2固體發(fā)酵根底培育基＝100:9:2，每1kg培育基中添加硫酸銨1.5%,水750ml,pH6.5。1.2.3液體發(fā)酵培育基豆餅粉3.65%0.625%0.625%,1.0%,CaCl20.5%,Na2HPO40.2%,6%,pH5.5。2、試驗方法1菌種的分別和純化承受常規(guī)稀釋分別法。2.2菌株的誘變處理2.2.1紫外線誘變處理用接種環(huán)取穎PDA稀釋,用血球計數(shù)板進展計數(shù),使每毫升溶液中孢子量約為5000個,取0.1ml涂布初篩平板,30℃培育4h,熱30min后，將平皿放置距離紫外燈30cm處分別照耀4min、6min、8min、10min、12min，隨后用5mL無菌生理鹽水將平皿上的菌洗脫，適當稀釋后，涂布于分別平皿，以黑布包裹30℃培育3-4天，從長出菌落與其水解圈直徑比的大小及菌落形態(tài)的變化，選擇所需菌種。2.2.2 亞硝基胍誘變處理用接種環(huán)取穎PDA斜面上的黑曲霉孢子少許,參與無菌水中50003ml于31℃振蕩處理1h,31℃培育5d,的菌落分別進展發(fā)酵試驗。2.3固體培育方法PDA斜面上的穎孢子接入裝有50g培育基的500ml三角瓶中,培育溫度為31℃,培育時間5d,2.4液體培育方法挑取一環(huán)生長在PDA斜面上的穎孢子接入裝有50ml基的500ml三角瓶中,培育溫度為31℃,培育時間3d,測定酶活。2.5固體培育方法挑取一環(huán)生長在PDA斜面上的穎孢子接入裝有50g培育基的500ml三角瓶中,培育溫度為31℃,培育時間5d,測定酶活。2.6液體培育方法挑取一環(huán)生長在PDA斜面上的穎孢子接入裝有50ml液體培育基的500ml三角瓶中,培育溫度為31℃,培育時間3d,測定酶活。2.7酶活測定方法酸性蛋白酶酶活力的測定承受河南省瑞特利生物技術(shù)產(chǎn)品企業(yè)標準〔Q／HRS018-2023〕相關(guān)方法。3、菌株選育結(jié)果紫外線誘變釋分別后涂布在分別平皿。紫外照耀孢子成活率結(jié)果如表1所示。表1紫外照耀孢子成活結(jié)果照耀時間〔min〕04681012活菌數(shù)〔個∕ml〕5000325021001350500100成活率〔%〕100654227102后,得到10O余株突變株。這些菌株在形態(tài)上有確定的差異，依照其從中選擇出20株先經(jīng)三角瓶液體發(fā)酵產(chǎn)酶測定,獲得10個高產(chǎn)菌株再經(jīng)三角瓶固體發(fā)酵培育復(fù)選，菌株產(chǎn)酸性蛋白酶活力如表2所示。其中5株產(chǎn)酶較高,分別為z-10株9284U/g〔干基〕、z-098887U、z-128645U/g〔干基〕、z-178199U/g〔干基〕、z-08株8018U/g〔干基〕。表2菌株產(chǎn)酸性蛋白酶活力菌株編號z-03z-05z-08z-09z-10z-12z-15z-17z-18z-20酶活力〔u∕mg〕7985772580208775923587647503814771337980酶活力〔u∕mg〕7996774680158998933285237589825072568005平均值〔u∕mg〕7991773680188887928486457546819971957993亞硝基胍誘變選擇經(jīng)紫外線誘變產(chǎn)酶最高的z-10菌株用亞硝基胍進展進一步誘變處理,由酪蛋白平板初篩得到菌株36株,經(jīng)搖瓶復(fù)篩得到菌株10株,此102.5萬U/g〔干基〕的菌株有4株,基中二株產(chǎn)酶最高,分別為Y06株36134U/g〔干基、Y05株34324U/g〔干基〕Y06株進展酸性蛋白酶生產(chǎn)性試驗。亞硝基胍誘變的結(jié)果如表3所示。表3菌株編號Y02Y05Y06Y08酶活力〔u∕mg〕26832341003594031080酶活力〔u∕mg〕26893345483632831056平均值〔u∕mg〕26863343243613431068材料與方法材料菌種，黑曲霉Y06，本工程選育保藏于河南省瑞特利生物技術(shù)。培育基和培育方法根底培育基、查氏培育基。培育方法．按要求配制發(fā)酵基質(zhì)，調(diào)整初始含水量和pH后，150g分裝于1000mL三角瓶中，在0．1Mpa壓力條件下滅菌30min后，冷卻接種，接種量為3%，于不同條件下發(fā)酵84h，枯燥后，進展酶活的測定。(1)不同比例碳源對酸性蛋白酶菌株產(chǎn)酶的影響按不同比例將玉米粉添加到根底培育基〔麩皮：豆粕：玉米淀粉＝100:9:2〕中，以補充碳源，于3O℃、初始pH值為6．5和含水量為38%條件下發(fā)酵，觀看補充玉米粉對酸性蛋白酶活性的影響，結(jié)果見圖1。由圖1可以得出，酸性蛋白酶菌株產(chǎn)酶最大時玉米粉添加量為37500〕g37500〕g35000〔力活酶白蛋性酸325003000027500250000.511.52玉米粉添加量/%2.53圖1不同比例氮源對酸性蛋白酶菌株產(chǎn)酶的影響33℃pH值為6．5和含水量為38%條件2。從圖2可以看出，在37500〕37500〕g35000〔力活酶白蛋性酸3250030000275002500003691215圖2水分含量對酸性蛋白酶菌株產(chǎn)酶的影響生長生殖。過高的含水量會導(dǎo)致培育基粘結(jié)成團，多孔性降低，影響氧的傳遞；含水量過低，則使基質(zhì)膨脹程度降低，水的活度低，從而pH值在33℃438%時酸性蛋白酶菌株產(chǎn)酶達最高值。3750037500〕350001U32500〔力活酶30000白蛋275002500030343842培育基含水量/%4650圖3pH值對酸性蛋白酶菌株產(chǎn)酶的影響37500)g37500)g35000力活酶白蛋性酸3250030000275002500055.566.577.5pH值圖4pH值對酸性蛋白酶菌株產(chǎn)酶的影響溫度對酸性蛋白酶菌株產(chǎn)酶的影響將發(fā)酵熱移出，將會使發(fā)酵溫度急劇上升，導(dǎo)致溫度失控，進而使發(fā)酵培育基含水量為38%、pH值為6．5的條件下培育84h，對27℃、3033℃37℃和40℃證明酸性蛋白酶菌株產(chǎn)酶發(fā)酵最適溫度為33℃，結(jié)果見圖5。3750037500)35000力活酶白蛋性酸32500300002750025000273033。溫度/C3639圖5溫度對酸性蛋白酶菌株產(chǎn)酶的影響不同銨鹽不同濃度對酸性蛋白酶菌株產(chǎn)酶的影響銨鹽作為重要的無機氮源對酸性蛋白酶菌株產(chǎn)酶的生產(chǎn)有很重分別參與不同濃度的氯化銨、硫酸銨、碳酸氫銨進展發(fā)酵試驗，發(fā)酵結(jié)果如圖66濃度的增加產(chǎn)酶量有下降的趨勢。氯化銨的濃度對產(chǎn)酶根本沒影響。碳酸氫銨隨著濃度的增加對產(chǎn)酶有很大的阻遏作用。4000040000〕/3000035000〔力活酶白蛋性酸2500020230150001000050000硫酸銨氧化銨碳酸氫銨0 2 46銨鹽濃度/%81012圖6不同銨鹽對酸性蛋白酶產(chǎn)酶的影響不同磷酸鹽對酸性蛋白酶菌株產(chǎn)酶的影響40000磷酸氫二鉀磷酸氫二銨〕375001-g〔力40000磷酸氫二鉀磷酸氫二銨〕375001-g〔力32500活酶30000白蛋27500350002500000.10.20.30.40.5磷酸鹽的濃度圖7磷酸鹽對酸性蛋白酶菌株產(chǎn)酶的影響3、酸性蛋白酶菌株發(fā)酵進程曲線含水量38pH值為6.50．2%的磷酸氫二鉀和硫酸銨在33℃進展發(fā)酵培育，爭論發(fā)酵進程曲線，結(jié)果如圖8。由酸性蛋白酶菌株發(fā)酵進程曲線可以看出，0～24h發(fā)酵產(chǎn)酶速度較緩；24～60h酸性〕到達36500U／g，為了縮短發(fā)酵周期，發(fā)酵最適時間為72h。〕〕375003500032500130000.27500〔力活酶白蛋性酸250002250020230175001500012500100007500500025000012243648607284發(fā)酵時間/h圖8五、酸性蛋白酶酶活力穩(wěn)定性爭論黑曲霉產(chǎn)的酸性蛋白酶因其最正確反響pH較低,與畜禽體內(nèi)消化腸道內(nèi)源蛋白酶分泌缺乏,提高蛋白質(zhì)消化率,降低畜禽代謝性腹道胃酸的影響,而且還受飼料中局部金屬離子的影響,而這些過程中〔Aspergillusniger所產(chǎn)酸性蛋白酶的穩(wěn)定性進展了爭論。1、pH值對酸性蛋白酶穩(wěn)定性的影響酸性蛋白酶在確定pH范圍內(nèi)酶活力比較穩(wěn)定〔9〕。當反響環(huán)境pH為3.5,85%,pH為4.0時,相對酶活力最高達90%,可以確定pH為4.0時是酸性蛋白酶最適反響pH值。pH值過高或過低明顯影響酶活力,在pH5.0時,相對酶活力只有65%,pH為2.5時,相對酶活力也只有70%。100100〕〔力活酶對相酶白蛋性酸80604022.533.5pH44.55圖9不同pH對酸性蛋白酶穩(wěn)定性的影響2、溫度對酸性蛋白酶酶活力和穩(wěn)定性的影響酸性蛋白酶在不同反響溫度下酶活力有很大差異〔10〕。一方面是當溫度上升時,酸性蛋白酶反響速率加快,另一方面由于隨著溫度的上升使酸性蛋白酶漸漸變性而失去活性,引起酶反響速率〕〔力活酶對相酶白蛋性酸100908070〕〔力活酶對相酶白蛋性酸10090807060504020253035404550圖10不同溫度對酸性蛋白酶酶活力的影響100酶對〕酶白力蛋活酸80402005圖1110 15 20時間〔min〕70C下酸性蛋白酶的存活曲線2530性03、不同金屬離子對酸性蛋白酶穩(wěn)定性的影響相60酶本身就是一種具有生物活性的蛋白質(zhì),確定溫度必定引起蛋白質(zhì)的變性從而使酶失活,隨著溫度的上升變性的時間越快,酶失活1170℃時,隨著時間的延長酶70℃保溫至5min保存有90%的相對酶80%，30min相60200〕〔力活酶對相酶白蛋性酸16012080400Fe3+Fe2+Ag+Zn2+Mn2+CKCu2+Ca2+K+Mg2+不同金屬離子200〕〔力活酶對相酶白蛋性酸16012080400Fe3+Fe2+Ag+Zn2+Mn2+CKCu2+Ca2+K+Mg2+不同金屬離子圖12不同金屬離子對酸性蛋白酶穩(wěn)定性的影響六、酸性蛋白酶生產(chǎn)工藝爭論在酸性蛋白酶的生產(chǎn)過程中，除了選擇生產(chǎn)性能優(yōu)良的酸性蛋白〕生產(chǎn)酸性蛋白酶的工藝流程為：原始菌株→分別純化→紫外線誘變→選育菌株分別→傳代試驗→選育菌株→斜面菌種→三角瓶菌種→淺盤菌種↓蒸料→冷卻→接種→發(fā)酵→穩(wěn)定化處理→枯燥→粉碎→包裝→檢測→成品↓圖13七、酸性蛋白酶的質(zhì)量指標〔Aspergillusniger〕生產(chǎn)的酸性蛋白和GB10648《飼料標簽》的要求，制定了酸性蛋白酶河南省瑞特利生〔Q／HRS018-2023〕，其質(zhì)量指標為：44酸性蛋白酶的質(zhì)量指標項目感官成品粒度酸性蛋白酶活力水分%砷〔以總As計〕u/gmg/kg鉛〔以Pb計〕mg/kg沙門氏菌數(shù)黃曲霉毒素B1大腸菌群數(shù)個/100g指標2.00mm分析篩≥8000≤10.0≤3.0≤10.0不得檢出≤10≤3000八、工程產(chǎn)品的創(chuàng)點八、工程產(chǎn)品的創(chuàng)點1、技術(shù)創(chuàng)2、工藝創(chuàng)〔Aspergillusniger2、工藝創(chuàng)了酸性蛋白酶發(fā)酵生產(chǎn)的技術(shù)工藝，并對有關(guān)的技術(shù)參數(shù)進展了優(yōu)3.應(yīng)用創(chuàng)酵生產(chǎn)酸性蛋白酶的生產(chǎn)技術(shù)體系。3.應(yīng)用創(chuàng)應(yīng)用效果顯著〔詳見附件一至附件七。本產(chǎn)品具有降低飼料本錢，防止腹瀉，增加機體免疫力，促進畜禽生長，改善畜禽產(chǎn)品品質(zhì)，促成效。本產(chǎn)品的使用效果到達甚至超過國內(nèi)外同類產(chǎn)品的水平。成效。本產(chǎn)品的使用效果到達甚至超過國內(nèi)外同類產(chǎn)品的水平。有重大的推廣應(yīng)用價值，經(jīng)濟效益、社會效益、環(huán)保效益格外顯著。九、產(chǎn)品的應(yīng)用爭論九、產(chǎn)品的應(yīng)用爭論制革工業(yè)、毛皮軟化和脫毛處理。近年來，由于酸性蛋白酶具有能快，促進動物特別是幼齡動物對多種養(yǎng)分物質(zhì)的吸取，促進其生長，增加機體抗病力氣。隨著集約化畜禽生產(chǎn)的進展，加劇了環(huán)境污染。利用效率，降低其排放就顯得尤為重要。此外，由于我國蛋白質(zhì)飼料劑，在飼料工業(yè)中表現(xiàn)出巨大的潛在價值，越來越受到飼料、養(yǎng)殖和動物養(yǎng)分界的高度重視。酶的作用和效果進展了系統(tǒng)爭論，其主要試驗結(jié)果為：1、酸性蛋白酶對生長肥育豬生長性能的影響爭論〔附件一〕白酶、微生態(tài)制劑與酸性蛋白酶合用分別提高了生長肥育豬日增重6.5％、7.5％、14.0％，4.8％、5.3％、10％，料肉1.6％、2.2％、3.680.82％、0.6％、1.35％。能顯著提高豬的日采食量、日增重、提高抗病力氣、增加經(jīng)濟效益。其組分來源于自然，應(yīng)用效果顯著，具有抗生素所不具有的優(yōu)點，符合綠色環(huán)保飼料的要求。2、酸性蛋白酶對仔豬的影響爭論〔附件二〕2、酸性蛋白酶對仔豬的影響爭論〔附件二〕吸取，促進其生長，增加機體抗病力氣。本爭論結(jié)果說明酸性蛋白酶在促進仔豬生長和提高仔豬飼料利用率以及預(yù)防疾病方面具有重要作用。7發(fā)生率極顯著地低于比照組〔P＜0.01〕。爭論說明酸性蛋白酶能夠提高其抗病性能，降低仔豬腹瀉率。3、酸性蛋白酶對蛋雞生產(chǎn)性能的影響爭論〔附件三〕本項試驗結(jié)果說明在蛋雞飼料中添加本項試驗結(jié)果說明在蛋雞飼料中添加0.02%的酸性蛋白酶可極顯組高6.83%，組日產(chǎn)蛋重比比照組高6.8%，組日均料蛋比比比照組下降6.450.02%酸性蛋白酶不能使每枚雞蛋的平均蛋重提高，但可以使組日產(chǎn)蛋量的提高和組日均料蛋比的下降。試驗結(jié)果說明，在日糧中添加0.02%的酸性蛋白酶，該組的蛋黃占整個蛋的百分比，比比照組提高了3.27%，提高幅度顯著；該組的蛋殼厚度比比照組下降4.65%，且下降幅度顯著；該組蛋的哈氏單位蛋殼厚度比比照組下降4.65%，且下降幅度顯著；該組蛋的哈氏單位比比照組提高了2.24%，但差異不顯著。本試驗結(jié)果說明，在飼料中添加0.02%的酸性蛋白酶，比比照的飼養(yǎng)毛利提高10.98%，顯著地提高了商品蛋雞的飼養(yǎng)效益，增加了本試驗結(jié)果說明，在飼料中添加0.02%的酸性蛋白酶，比比照的飼養(yǎng)毛利提高10.98%，顯著地提高了商品蛋雞的飼養(yǎng)效益，增加了養(yǎng)殖戶的收入。在飼料中添加0.02%的低聚木糖后，雖然該組蛋雞的蛋雞對飼料的消化吸取率。4、酸性蛋白酶與微生態(tài)制劑及抗生素對肉雞腸道菌群和生產(chǎn)性能的影響爭論〔附件四〕進了空腸乳酸菌的增殖，以添加0.02%酸性蛋白酶＋0.005%微生態(tài)制同作用。同作用。5、酸性蛋白酶對犢牛腹瀉的影響爭論〔附件五〕5、酸性蛋白酶對犢牛腹瀉的影響爭論〔附件五〕本試驗添加10g/(d頭〕組在削減腹瀉方面的效果不及添加5g/(d.頭〕組?？赡苁怯捎谶^量添加造成的負面影響，具體緣由有待進一步爭論。6、酸性蛋白酶和微生態(tài)制劑配伍在肉兔飼料中的應(yīng)用爭論〔附6、酸性蛋白酶和微生態(tài)制劑配伍在肉兔飼料中的應(yīng)用爭論〔附件六〕件六〕酸性蛋白酶與微生態(tài)制劑混合物進入腸道后可產(chǎn)生確定的協(xié)同作酸性蛋白酶與微生態(tài)制劑混合物進入腸道后可產(chǎn)生確定的協(xié)同作使益生菌作用更長期。0.020.2%使益生菌作用更長期。0.020.2%兔無任何毒副作用，是抱負的肉兔綠色飼料添加劑。 7、酸性蛋白酶對草魚生長性能的影響爭論〔附件七〕0.040.040.06%〔P0.05十、經(jīng)濟效益、社會效益1、經(jīng)濟效益分析〔1〕降低本錢：酸性蛋白酶替代促生長抗生素添加在飼料中，肉比、料蛋比，節(jié)約飼料或者提高出肉率、降低養(yǎng)殖本錢；使用酸性蛋白酶，可改善了肉、蛋的品質(zhì)，提高肉、蛋的附加值，直接增加養(yǎng)肉比、料蛋比，節(jié)約飼料或者提高出肉率、降低養(yǎng)殖本錢；使用酸性蛋白酶，可改善了肉、蛋的品質(zhì)，提高肉、蛋的附加值，直接增加養(yǎng)殖戶的收入?！?〕改善養(yǎng)殖環(huán)境：飼料中添加酸性蛋白酶后，養(yǎng)殖動物的糞〔2〕改善養(yǎng)殖環(huán)境：飼料中添加酸性蛋白酶后，養(yǎng)殖動物的糞便中削減了氨、氮的排放量，同時避開了因氨、氮排放量過大導(dǎo)致的動物多種疾病，削減動物發(fā)病率。動物多種疾病，削減動物發(fā)病率?！?〕料肉比〔料蛋比〕降低：酸性蛋白酶具有能快速有效地幫助〔4〕延長蛋雞產(chǎn)量頂峰期：添加酸性蛋白酶飼養(yǎng)蛋雞，可延長化率和吸取率，可有效地降低料肉比〔料蛋比?！?〕延長蛋雞產(chǎn)量頂峰期：添加酸性蛋白酶飼養(yǎng)蛋雞，可延長1—31—3來了巨大的經(jīng)濟效益?！?〕由于我國蛋白質(zhì)飼料資源嚴峻缺乏，需要尋求格外規(guī)蛋白資源，而動物對格外規(guī)蛋白飼料的利用效率很低。因此，酸性蛋白酶價值，越來越受到飼料、養(yǎng)殖和動物養(yǎng)分界的高度重視。2、社會效益分析2、社會效益分析物質(zhì)在肉蛋中的殘留，真正實現(xiàn)了無藥物殘留、無致癌物殘留、無污染殘留的綠色肉制品、蛋制品的生產(chǎn)，為人類安康做出了巨大奉獻。3、應(yīng)用前景加劑取代當前大量使用的促生長類抗生素和激素類飼料添加劑作為飼料工業(yè)進展的必由之路。酸性蛋白酶產(chǎn)品長期生產(chǎn)和應(yīng)用，無污染、無殘留，符合綠色飼性蛋白酶能促進動物的生長，特別是對幼齡動物的作用格外明顯。2023年，我國飼料總產(chǎn)量已達1.4億噸以上，已成為世界其次大飼料加劑取代當前大量使用的促生長類抗生素和激素類飼料添加劑作為飼料工業(yè)進展的必由之路。酸性蛋白酶產(chǎn)品長期生產(chǎn)和應(yīng)用，無污染、無殘留，符合綠色飼料添加劑的要求和國家大力進展生態(tài)農(nóng)業(yè)和綠色食品的產(chǎn)業(yè)化政策，料添加劑的要求和國家大力進展生態(tài)農(nóng)業(yè)和綠色食品的產(chǎn)業(yè)化政策，顯著，必將促進我國飼料工業(yè)和畜牧養(yǎng)殖業(yè)安康快速的進展。十一、存在的問題及建議順應(yīng)了以非藥物添加劑替代抗生素作為畜禽防病、促生長的進展趨勢，具有重大的推廣應(yīng)用價值，經(jīng)濟效益、社會效益、環(huán)保效益格外顯著，必將促進我國飼料工業(yè)和畜牧養(yǎng)殖業(yè)安康快速的進展。十一、存在的問題及建議闊的應(yīng)用前景但目前酸性蛋白酶的使用上還存在很多問產(chǎn)品的作用機理尚未完全爭論清楚各爭論報道的結(jié)果存在較大差異品動物養(yǎng)分學(xué)爭論進展方向應(yīng)是：動物養(yǎng)分學(xué)爭論進展方向應(yīng)是：1、目前作為飼料添加劑使用的酸性蛋白酶一般是添加于粉料中身耐熱穩(wěn)定性。3、對酸性蛋白酶影響動物養(yǎng)分物質(zhì)代謝的精準機制作進一步研2、目前使用的酸性蛋白酶生產(chǎn)菌株產(chǎn)酶水平都普遍較低，產(chǎn)品明前景。3、對酸性蛋白酶影響動物養(yǎng)分物質(zhì)代謝的精準機制作進一步研的適宜添加劑量，為飼料工業(yè)中科學(xué)合理使用酸性蛋白酶供給依據(jù)。學(xué)技術(shù)的不斷進展，這些問題都會得到徹底解決。無論如何，酸性蛋白酶的本質(zhì)特性和應(yīng)用效果打算了其進展和應(yīng)用的前景格外寬闊。附件一酸性蛋白酶對生長肥育豬生長性能的影響爭論材料和方法8000u∕g。分是枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌、酵母菌。72418130.02％酸性蛋白酶；40.02％0.15％的微生態(tài)制劑。154喂前空腹進展。計算平均日增重、飼料轉(zhuǎn)化率、飼料本錢，并對計算結(jié)果進展統(tǒng)計分析。試驗地點：武陟縣城關(guān)鎮(zhèn)尚武養(yǎng)殖場。2023916103045540日糧組成12日糧組成1234玉米50.050.050.050.0濃縮飼料20.020.020.020.0米 糠18.018.018.018.0麩 皮12.011.8511.9811.83微生態(tài)制劑0.00.150.00.15酸性蛋白酶0.00.00.020.02合 計100.0100.0100.0100.0粗蛋白質(zhì)〔%〕15.515.515.515.5鈣〔%〕0.600.600.600.60有效磷〔%〕0.300.300.300.30賴氨酸〔%〕0.800.800.800.80飼料本錢〔元/噸〕1768.81780.81769.81808.8試驗結(jié)果分析飼養(yǎng)試驗結(jié)果對平均日增重的影響4022試驗各組平均日增重〔單位：千克/頭、克/頭-日、％〕組別頭數(shù)天數(shù)平均始重平均末重平均日增重相比照較1184076.6±0.54105.5±1.59750.7±27.1100.02184075.5±0.68105.8±1.82799.3±22.2106.53184076.2±0.62106.8±1.43802.3±29.3107.54184076.0±0.51108.45±1.39855.9±28.7114.0能有效地提高生長豬的平均日增重6.7.5414％。對采食量及飼料轉(zhuǎn)化率的影響403表3試驗全期采食量及飼料轉(zhuǎn)化率〔單位：千克/頭、克/頭-日、％〕組別頭數(shù)天數(shù)總耗料量日采食重料肉比料肉比比較11840166025653.41100.021840174026883.3598.431840174827003.3397.841840182628213.2896.4量，微生態(tài)制劑組、酸性蛋白酶組、微生態(tài)制劑與酸性蛋白酶合用組較比照組分別提高采食量4.82%5.3%,10%.分別降低料肉比1.6%,2.2%,3.6%.豬的發(fā)病率及安康狀況試驗過程中，無死亡，無腹瀉，豬仔有發(fā)熱現(xiàn)象，各組的發(fā)病率4。4試驗各組的發(fā)病率〔單位：％〕組別頭數(shù)天數(shù)飼養(yǎng)頭數(shù)發(fā)病頭次數(shù)發(fā)病率發(fā)病率比較11840720162.22100.02184072081.1150.03184072060.8337.441840720000發(fā)病率〔％〕＝累計發(fā)病頭日數(shù)/累計飼養(yǎng)頭日數(shù)×100發(fā)病率，酸性蛋白酶與微生態(tài)制劑合用組能明顯提高豬仔的抗病力。經(jīng)濟分析5試驗各組豬的經(jīng)濟效益分析〔單位：元/千克、％〕組別頭數(shù)天數(shù)飼料本錢增值本錢增重本錢比較118401.76886.032100.00218401.78085.98399.18318401.79686.00099.40418401.80885.95198.650.82％、0.6％、1.35%。爭論與分析酶、微生態(tài)制劑與酸性蛋白酶合用分別提高了生長肥育豬日增重6.5％、7.5％、14.0％，4.8％、5.3％、10％，料肉1.6％、2.2％、3.680.82％、0.6％、1.35％。本次試驗只計算了飼料本錢與增重的關(guān)系。結(jié)論能顯著提高豬的日采食量、日增重，提高抗病力氣，增加經(jīng)濟效益。其組分來源于自然，應(yīng)用效果顯著，具有抗生素所不具有的特點，符合綠色環(huán)保飼料的要求。隨著人們對綠色、安全和環(huán)保意識的增加，它產(chǎn)生的社會效益將得到更多有識之士的認可，應(yīng)用前景更加寬闊。附件二

酸性蛋白酶對仔豬的影響爭論的影響爭論。材料和方法試驗動物20234920235293520210721日齡斷奶，仔豬料為常規(guī)飼料〔含抗生素，由0.02%的酸性蛋白酶。試驗豬實行高床飼養(yǎng)，進展有關(guān)資料的記錄與收集，包括：初生重，72135日齡窩重，仔豬腹瀉頭數(shù)，飼料量等。樣品來源8000u∕g。數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析應(yīng)用ExcelSPSS分析，并用LSD結(jié)果與分析酸性蛋白酶對仔豬增重的影響721〔P＞0.05〕，就其量少而導(dǎo)致日增重有低于比照組的趨勢〔243.60±21.83對248.00±42.46，P＞0.05〕。斷奶后經(jīng)過斷奶、免疫、去勢的應(yīng)激，添加酸性蛋白酶組的試驗豬表現(xiàn)出高于比照組的趨勢〔試驗組146.85±35.07，比照142.17±46.80，P＞0.05〕。項目比照組試驗組項目比照組試驗組帶 仔頭 數(shù)11.65±1.0310.78±1.63初 生重〔㎏〕1.26±0.171.40±0.617日齡重〔㎏〕2.35±0.312.41±0.3121〔㎏〕5.90±0.715.97±0.5435日齡重〔㎏〕7.82±0.617.96±0.770-7日增重〔g〕139.83±42.46140.49±27.368-21〔g〕248.00±45.25243.60±21.838-35〔g〕142.17±46.80146.85±35.078-35〔g〕196.08±22.35196.27±21.890-35〔g〕185.85±21.30186.14±20.21酸性蛋白酶對仔豬料重比的影響28-2135.29%〔P＜0.05〕，8-3520.53%〔P＜0.05〕。飼喂酸性蛋白酶處理組8-21日齡飼料效率比比照組削減了34.6%P＜0.05〕，8-3520.32%〔P＜0.05〕行業(yè)具有直接的經(jīng)濟效益。2酸性蛋白酶對仔豬飼料利用率的爭論Wg8-21wg22-35Wg8-35Fi8-21fi22-35Fi8-35Fcr8-21fcr22-35Fcr8-35246.00144.18195.09255a205.77455.67a1.04a1.381.23a241.61148.96195.28165b202.09362.09b0.68b1.310.98b-1.783.320.10-35.29-1.78-20.53-34.62-5.07-20.32組別比照組酶組別比照組酶組差異％酸性蛋白酶對仔豬腹瀉的影響3。07〔22.88％，P＞0.05〕；7210.45〔低26.66%,P＞0.05〕；20.82〔57.75%,P＜0.01〕。可見，酸性蛋白酶具有明顯的提高仔豬的抗病性能的作用。3酸性蛋白酶對仔豬腹瀉的影響的爭論差異1.43-0.45-0.820.19-0.23％22.88-26.66-57.744.48-7.23組別0-78-21組別0-78-2122-350-210-35比照組6.251.691.42A4.253.18酸性蛋白酶組7.681.240.60B4.442.95結(jié)果爭論7發(fā)生率極顯著地低于比照組〔P＜0.01〕。爭論說明飼料中添加酸性仔豬的應(yīng)激，促進仔豬的安康，提高其抗病性能，降低仔豬腹瀉率。附件三

酸性蛋白酶對蛋雞生產(chǎn)性能的影響爭論材料與方法試驗材料本次試驗的酸性蛋白酶由河南省瑞特利生物技術(shù)供給。試驗雞種為羅曼雞。試驗時間和地點11驗時間為2023年9月19日至2023年11月27日，其中頭11天為預(yù)試期，后60天為正試期。試驗設(shè)計將12006450羽；其中第一組為空白比照組、其次組為添加0.01%酸性蛋白酶組、第三組為添加0.015%酸性蛋白酶組、第四組為添加0.02%酸性蛋白酶組、第五組為添加0.025%酸性蛋白酶組、第六組為添加0.03%酸性蛋白酶組。試驗根底日糧配方蛋雞常規(guī)飼料配方為：玉米62、豆粕25、貝殼8、預(yù)混料5%1%的魚粉，并添加了蛋氨酸。試驗蛋雞的飼養(yǎng)治理16小時。每只蛋雞日平均飼喂料兩次，第一次在上午8點，飼喂量為全天所需飼喂量的60%，其次次在下午4點，飼喂量為全天所需飼喂量的40%。飼養(yǎng)方式為三層階梯式籠養(yǎng)，每籠3只雞。預(yù)試期雞群調(diào)整方法在預(yù)試期開頭時，將雞舍內(nèi)各籠內(nèi)的蛋雞數(shù)均調(diào)整為每籠3只，11天后按各重復(fù)小組統(tǒng)時的產(chǎn)蛋數(shù)根本相等。測定指標試驗期間每天下午3點分籠記錄產(chǎn)蛋數(shù)、分重復(fù)組稱測產(chǎn)蛋重，10標測定。統(tǒng)計分析方法將試驗原始記錄資料輸入到SPSS數(shù)據(jù)處理，多重比較承受LSD。表1 酸性蛋白酶對蛋雞生產(chǎn)性能的影響項

產(chǎn)蛋率〔%〕產(chǎn)蛋總重/日蛋重/枚〔g〕84.00eCD±5.862.50dD±0.1766.15bB±1.56

料蛋比2.17dD±0.160.01%酸性蛋白酶86.59eB±5.192.61bB±0.2066.90aA±3.960.015%酸性蛋白酶89.74aA±4.832.67aA±0.1566.19bB±1.48

2.08bB±0.142.03aA±0.120.02%酸性蛋白酶88.60bA±5.212.64aAB±0.1666.40bB±1.460.025%酸性蛋白酶85.23dC±5.522.54cC±0.1666.27bB±1.710.03%酸性蛋白酶83.90eD±5.942.46eD±0.1765.35eC±1.51

2.05AB±0.122.13cC±0.142.21eE±0.16注：以上同列不同字母表示差異，其中小寫字母表示差異顯著〔大寫字母表示差異極顯著〔P<0.01，下同。結(jié)果與分析酸性蛋白酶對蛋雞產(chǎn)蛋率的影響著性分析檢驗說明，0.015%酸性蛋白酶組和0.02%酸性蛋白酶組的產(chǎn)P<0.00.01極顯著高于空白比照組P<0.00.025%酸性蛋白酶組的產(chǎn)蛋率顯著高于空白比照組P<0.00.015。酸性蛋白酶對蛋雞產(chǎn)蛋重的影響P<0.00.01蛋白酶組和0.025%酸性蛋白酶組的每日平均產(chǎn)蛋總重均顯著高于比照0.03P<0.00.03%酸性蛋白酶組P<0.00.015重為最高。酸性蛋白酶對蛋雞平均蛋重的影響〔P<0.00.03它各組的平均蛋重P<0.0。酸性蛋白酶對蛋雞料蛋比的影響10.010.015%酸性蛋白酶組和0.02%0.025%酸性蛋白酶組0.03P<0.00.015比極顯著低于0.01%酸性蛋白酶組的料蛋比；各組間以0.015%酸性蛋白酶的料蛋比為最低。各組蛋品質(zhì)分析結(jié)果在試驗完畢前，選取試驗效果比較顯著的0.015%酸性蛋白酶和0.02%酸性蛋白酶組的蛋與比照組的蛋進展蛋品質(zhì)量比較分析，結(jié)果0.02P>0.0蛋形指數(shù)〔長徑比橫徑〕上，0.015%酸性蛋白酶組顯著高于0.02%酸性蛋白酶組〔P<0.05，但二組與空白比照組間沒有顯著差異〔P>0.05；在蛋殼厚度上，空白比照組極顯著高于兩個試驗組的蛋殼厚度〔P<0.01；在蛋黃百分率上，0.015比照組P<0.0〔。表2 酸性蛋白酶對雞蛋常規(guī)品質(zhì)的影響工程蛋形指蛋殼強度數(shù) 〔㎏/㎝2〕蛋殼厚度〔㎜〕蛋黃比色蛋殼百分率〔%〕蛋黃百分率〔%〕哈氏單位空白比照1.31abA±13.41a±0.045 3.060.43aA±0.039.10a±0.7912.40a±0.9125.06bA±1.7875.45a±6.950.015%酸性蛋白酶1.32aA±14.53a±0.036 2.790.41bB±0.039.36a±0.7912.22a±0.0125.88aA±1.4775.14a±7.780.02%酸性蛋白酶1.30bA±13.90a±0.032 2.800.40bB±0.029.16a±0.6812.40a±0.6125.16abA±1.7275.06a±12.02酸性蛋白酶對蛋雞飼養(yǎng)效益的影響計算依據(jù)：各試驗組雞數(shù)200只，平均日投放飼料0.120kg/只，本次試驗期共進展了60天。以本次試驗期60天計算毛利。雞蛋8.00元/kg，飼料2.40元/kg，酸性蛋白酶按12元/kg計算公式加量，按以下公式計算毛利潤〔即包括勞動力工資在內(nèi)的純收入：毛利潤〔元〕蛋重×8.00－飼料×2.40－酸性蛋白酶費用試驗期各組雞的毛利潤分析現(xiàn)以在日糧中添加0.015%和0.02%酸性蛋白酶的結(jié)果進展各組雞在飼料中添加0.015%0.02%10.98%和8.920.015%的酸性蛋白酶，則每只蛋雞每月可多獲毛利0.171000將蛋雞飼養(yǎng)101770濟和社會效益格外可觀〔。表3 試驗期各組獲毛利分析項目空白比照組0.015%酸性蛋白酶組0.02%酸性蛋白酶組總蛋重〔㎏〕157.39168.08166.53蛋收入〔元〕1101.731176.561165.71飼料重〔㎏〕340.2340.2340.2飼料費〔元〕476.28476.28476.28酸性蛋白酶用量〔克〕05168酸性蛋白酶費用〔元〕00.610.82毛利〔元〕625.45694.16681.27比比照組增毛利〔元〕-+68.71+55.823結(jié)論與爭論添加0.015%的酸性蛋白酶能促進蛋雞生產(chǎn)性能的提高0.015%的酸性蛋白酶可極顯著高6.83%，組日產(chǎn)蛋重比比照組高6.8%，組日均料蛋比比比照組下降6.45%。結(jié)果說明：在日糧中添加0.015%酸性蛋白酶不能使每枚雞蛋的平均蛋重提高，但可以使組日產(chǎn)蛋量的提高和組日均料蛋比的下降。添加酸性蛋白酶不會降低蛋的品質(zhì)0.015占整個蛋的百分比，比比照組提高了3.27%，提高幅度顯著；該組的蛋殼厚度比比照組下降4.65%，且下降幅度顯著；該組蛋的哈氏單位比比照組提高了2.24%，但差異不顯著，其他常規(guī)指標間沒有顯著差異。在飼料中添加酸性蛋白酶能提高蛋雞的飼養(yǎng)效益本試驗結(jié)果說明，在飼料中添加0.015%的酸性蛋白酶，比比照的飼養(yǎng)毛利提高本試驗結(jié)果說明，在飼料中添加0.015%的酸性蛋白酶，比比照的飼養(yǎng)毛利提高10.98%，顯著地提高了商品蛋雞的飼養(yǎng)效益，增加了養(yǎng)殖戶的收入。在飼料中添加0.015%的酸性蛋白酶后，雖然該組高蛋雞對飼料的吸取率。高蛋雞對飼料的吸取率。附件四附件四酸性蛋白酶與微生態(tài)制劑及抗生素對酸性蛋白酶與微生態(tài)制劑及抗生素對肉雞腸道菌群和生產(chǎn)性能的影響爭論飼料料轉(zhuǎn)化率。飼料中添加抗生素、微生態(tài)制劑、酸性蛋白酶均能影飼料料轉(zhuǎn)化率。飼料中添加抗生素、微生態(tài)制劑、酸性蛋白酶均能影成為飼料添加劑熱點之一。材料與方法1.12023111.12023111920231231行。1.2試驗動物與試驗設(shè)計1AA12006825〔16.7mg.3.3mg.㎏，比照組、0.02%酸性蛋白酶、0.005%酸性蛋白酶＋0.005%微生態(tài)制劑、0.01%酸性蛋白酶＋0.005%微生態(tài)制性蛋白酶＋0.005%微生態(tài)制劑、0.01%酸性蛋白酶＋0.005%微生態(tài)制劑、0.005%酸性蛋白酶＋抗生素〔同比照組〕和0.01%酸性蛋白酶＋抗生素〔同比照組。乳桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌。酸性蛋白酶由河南省瑞特利生物技術(shù)供給。1.3試驗日糧及飼料治理乳桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌。酸性蛋白酶由河南省瑞特利生物技術(shù)供給。1.3試驗日糧及飼料治理1。試驗雞承受層疊籠飼養(yǎng)，自由飲水，自由采食，241試驗根底日糧配方及養(yǎng)分含量原料〔%〕0—21d22—42d玉米6268豆粕33275%預(yù)混料55養(yǎng)分水平〔%〕//ME〔Mcal/kg〕12.1212.54Cp2119Ca0.90.85Ap0.480.43Lys0.980.88Met＋Cys0.770.67注：5%預(yù)混料含氨基酸、微量元素和維生素等。1.4測定指標與方法1.4.1注：5%預(yù)混料含氨基酸、微量元素和維生素等。1.4測定指標與方法1.4.12142雞只死亡數(shù)；計算增重、飼料轉(zhuǎn)化率和死亡率。1.4.2.11.4.2.11.4.2.2內(nèi)容物稀釋429.006取出并結(jié)扎空腸，用酒精棉球消毒各結(jié)扎口，然后放入消毒容器內(nèi)。測定乳酸桿菌的樣品厭氧采樣。1.4.2.2內(nèi)容物稀釋0.5g4.5ml3～5min1.4.2.3250r/m1-11000r/min4.5ml10-210-3—10-6倍稀釋。1.4.2.310μlNo.3平皿上〔各稀釋度設(shè)設(shè)3個重復(fù)37C有氧培育24h后進展菌落計數(shù)。10-3-10-610ml選擇性培育平皿上〔各稀釋度設(shè)3個重復(fù)，37℃厭氧培育48h后進展菌落計數(shù)。細菌個數(shù)的對數(shù)lg〔CFU〕表示。1.5統(tǒng)計分析1.5統(tǒng)計分析試驗數(shù)據(jù)承受SPSS11.0One-WayANOVADuncan結(jié)果與分析2.12.1各組試驗雞的體增重、飼料轉(zhuǎn)化率及死亡率如表2、3.與抗生素比照組相比，個試驗組前期、后期和全期的體增重分別提高了0.8%—15.1%、2.9%—29.02.2%—4.00.01%酸性蛋白酶＋0.0050.0050.01%酸性蛋白酶＋0.005%酸性蛋白酶＋0.005%微生態(tài)制劑顯著提高試驗雞全期增重〔p<0.05〕,tianj0.02%酸性蛋白酶組試驗雞體增重改善不顯著2.2表2酸性蛋白酶與抗生素、微生態(tài)制劑對肉雞體增重的影響p>0.0，酸性蛋白酶＋微生態(tài)制劑或抗生素組試驗雞全期增重提0.023—75—110.005%酸性蛋白酶＋抗生素顯著地提高了試驗雞全期的體增重p<0.0。各試驗組肉雞后期和全期的6.2%、7.1%、6.2%，各試驗組肉雞死亡率凹凸不一，提示添加抗生素0.005%酸性蛋白酶＋抗生素的效果為最正確。2.2表2酸性蛋白酶與抗生素、微生態(tài)制劑對肉雞體增重的影響組別0-21日體增重〔g〕改善程度〔%〕22-42日體增重〔g〕 改善程〔%〕0-42日體增重〔g〕改善程度〔%〕1598±7aA ＋01189±38aA ＋01787±38aA ＋02603±10aA ＋0.81224±44aA ＋2.91826±48abA ＋2.23617±6aA ＋3.21290±36abAB ＋8.51907±39bA ＋6.74660±8bB ＋10.41406±38dBC ＋18.32066±40cB ＋15.65681±11bcB＋13.91534±22ec ＋292215±16dC ＋246688±8cB ＋15.11390±29bcB ＋16.92078±32cBC ＋16.3注：同一列小寫字母不同者表示差異顯著〔p<0.05〕,大寫字母表示注：同一列小寫字母不同者表示差異顯著〔p<0.05〕,大寫字母表示〔p<0.01〕3酸性蛋白酶與抗生素、微生態(tài)制劑對肉雞飼料轉(zhuǎn)化率、死亡率的影響0-21日22-42日0-42日組別飼料轉(zhuǎn)化率死亡率〔%〕飼料轉(zhuǎn)化率死亡率〔%〕飼料轉(zhuǎn)化率死亡率〔%〕11.471.002.796.572.107.5021.531.002.729.602.0810.5031.580.502.676.532.037.0041.390.502.507.541.978.0051.581.002.324.551.955.5061.421.002.116.061.977.00表表4酸性蛋白酶與抗生素、微生態(tài)制劑對肉雞空腸菌群的影響組別大腸桿菌乳酸菌1.抗生素〔比照組〕3.366±0.403aA5.671±0.226aA2.0.02%酸性蛋白酶4.98±0.365bB6.799±0.421bA3.0.005%酸性蛋白酶＋0.005%微生態(tài)制劑4.696±0.292bAB6.191±0.115abA4.0.01%酸性蛋白酶＋0.005%微生態(tài)制劑4.588±0.562bAB6.817±0.231bA5.0.005%酸性蛋白酶＋抗生素3.251±0.234aAB6.464±0.310ahA6.0.01%酸性蛋白酶＋抗生素4.024±0.377abAB6.621±0.219bAlgCFU/glgCFU/g者表示差異顯著p<0.0〕p<0.0。40.020.005%酸性蛋白酶＋0.005%微生態(tài)制劑、微生態(tài)制劑、0.01%酸性蛋白酶＋0.005%微生態(tài)制劑組試驗雞空腸大腸桿菌數(shù)量較比照組高〔P<0.05，抗生素更有效的抑制了空腸大腸桿菌的增殖，添加0.005%酸性蛋白酶＋抗生素組試驗雞大腸桿菌數(shù)量顯著低于0.020.005%微生態(tài)制劑組〔P<0.05〕和0.010.005P<0.0組比，各試驗組肉雞空腸乳酸菌數(shù)量分別增加19.89〔P<0.0、9.1720.21P<0.05、13.98P<0.0〕和16.75%P<0.0，各試驗組之間乳酸菌數(shù)量差異不顯著P<0.0。3.爭論態(tài)制劑聯(lián)用均有效的促進了空腸乳酸菌的增殖，以添加0.01%酸性蛋白酶＋0.005生素的緩解作用沒有累加效果。菌增殖的趨勢。最正確添加量組合的爭論尚待進一步試驗。附件五附件五酸性蛋白酶對犢牛腹瀉的影響爭論酸性蛋白酶對犢牛腹瀉的影響爭論一、材料和方法 1、試驗材料酸性蛋白酶由河南省瑞特利生物技術(shù)供給。2、試驗動物與試驗設(shè)計酸性蛋白酶由河南省瑞特利生物技術(shù)供給。2、試驗動物與試驗設(shè)計20235975、10g/〔g.頭〕的酸性蛋白酶。三組犢牛的初始體重差異均不顯著〔P﹥0.05。60日齡斷奶。每組采食一樣的精料補充料〔開食料〕5、10g/〔g.頭〕的酸性蛋白酶。三組犢牛的初始體重差異均不顯著〔P﹥0.05。60日齡斷奶。每組采食一樣的精料補充料〔開食料〕42d。12。日 糧含量〔%〕養(yǎng)分水平含量〔%〕日 糧含量〔%〕養(yǎng)分水平含量〔%〕玉米42粗蛋白〔%〕19.5豆粕19粗脂肪〔%〕5.4小麥麩15粗纖維〔%〕8.25DDG16鈣〔%〕0.96磷酸氫鈣1.5總磷〔%〕0.64食鹽0.5糖蜜5預(yù)混料1合 計1002試驗設(shè)計方案組別5g(d.頭〕組

飼糧組成牛奶＋開食料＋5g/(d.頭〕的酸性蛋白酶10g/(d.頭〕的酸性蛋白酶3、飼養(yǎng)治理3、飼養(yǎng)治理本爭論試驗各組均是在光照通風(fēng)等環(huán)境和飼養(yǎng)治理條件全都的本爭論試驗各組均是在光照通風(fēng)等環(huán)境和飼養(yǎng)治理條件全都的狀況下進展的。10粉，涂擦與犢?？诒?，教其舔食。7飼喂方法：于飼喂前將酸性蛋白酶拌于飼料中，分早、中、晚3710粉，涂擦與犢牛口鼻，教其舔食。7誘其自由飲用。4、測定指標和方法4.1腹瀉指數(shù)最終以每組犢牛發(fā)生腹瀉的頭日數(shù)除以總飼養(yǎng)頭日數(shù)計算出腹瀉指數(shù)。4.1腹瀉指數(shù)最終以每組犢牛發(fā)生腹瀉的頭日數(shù)除以總飼養(yǎng)頭日數(shù)計算出腹瀉指數(shù)?！?00%42105、數(shù)據(jù)處理SAS8.1Duncan`s。二、結(jié)果與分析酸性蛋白酶酸性蛋白酶對犢牛腹瀉指數(shù)的影響〔見表3〕3酸性蛋白酶對犢牛腹瀉指數(shù)的影響項 目項 目樣本數(shù)腹瀉指數(shù)〔%〕比照組104.25g/(d.頭〕組1