菌種管理操作規(guī)程

菌種管理操作規(guī)程1.目的規(guī)范本中心標(biāo)準(zhǔn)菌種和野生菌種的管理。2.范圍本規(guī)程適用于標(biāo)準(zhǔn)菌種和實驗過程中分離純化的野生菌種的管理。3.職責(zé)3.1菌種管理員：負(fù)責(zé)菌種的申購、接收、保存、分發(fā)。3.2微生物檢驗員：負(fù)責(zé)菌種的確認(rèn)、傳代、使用及銷毀。3.3科室負(fù)責(zé)人：負(fù)責(zé)指導(dǎo)、監(jiān)督檢驗員和管理員對菌種的管理。4.術(shù)語4.1標(biāo)準(zhǔn)菌種(凍干菌種)：由國內(nèi)或國際菌種保藏機構(gòu)保藏的，遺傳學(xué)特性得到確認(rèn)和保證并可追溯的菌種。4.2標(biāo)準(zhǔn)儲備菌種：又稱傳代用菌種，由標(biāo)準(zhǔn)菌種經(jīng)一次傳代得到的培養(yǎng)物，是指用標(biāo)準(zhǔn)菌種制備的采用特定保存方法長期固定保存的菌種，用于傳代及制備工作菌種。4.3工作菌種：工作菌種是指用標(biāo)準(zhǔn)菌種或標(biāo)準(zhǔn)儲備菌種接種至普通瓊脂斜面培養(yǎng)后，作為日常工作使用的菌種。4.4代：菌種的代是指將其接種至一新鮮培養(yǎng)基上或培養(yǎng)基內(nèi)，每萌發(fā)一次即稱為一代，從菌種保藏中心獲得的冷凍菌種為第0代（G0）。5.程序5.1菌種的申購菌種管理員每年根據(jù)菌種的使用情況（包括臨時檢驗需要）提出購買計劃，經(jīng)批準(zhǔn)后，向菌種保藏中心購買標(biāo)準(zhǔn)菌種（凍干菌種），采購執(zhí)行《服務(wù)和供應(yīng)品的采購程序》。5.2菌種的接收菌種到達(dá)實驗室后，由菌種管理員接收菌種，檢查其名稱和數(shù)量，以及每一支的完整性，同時將菌種的所有信息，填寫《標(biāo)準(zhǔn)菌種接收記錄表》，貼好標(biāo)簽并按照該菌適宜儲存條件進行儲存（儲存期及儲存條件見菌種說明書）。5.3菌種的編號5.3.1標(biāo)準(zhǔn)/標(biāo)準(zhǔn)儲備菌種采用字母加數(shù)字表示：英文縮寫字母-來源編號-代次-傳代日期-順序號。菌種的英文縮寫字母：大腸埃希菌（E.c）、金黃色葡萄球菌（S.a）、枯草芽孢桿菌（B.s）、黑曲霉菌（A.n）、白假絲酵母（C.a）等，來源以購進方編號為準(zhǔn)；代數(shù)用一位帶有下標(biāo)數(shù)字的字母表示；標(biāo)準(zhǔn)/標(biāo)準(zhǔn)儲備菌種用G表示；工作菌種用W表示；如G3表示標(biāo)準(zhǔn)菌種第3代；W3表示工作用菌種第3代。傳代日期用6位數(shù)字表示：年份取最后兩位數(shù)，月、日分別用兩位數(shù)。如2012年1月12日傳代的第一支來源于CICC編號為23657的大腸埃希菌作為傳代用菌種的編號為：E.c-CICC23657-G3-120112-01。另外標(biāo)準(zhǔn)菌種編號為E.c-CICC23657-G0（無傳代日期和順序號）。5.3.2野生菌種采用字母加數(shù)字表示：英文縮寫字母-來源縮寫（野生-Y.s）-代次-傳代日期-順序號。菌種的英文縮寫字母：如經(jīng)過菌種確認(rèn)英文縮寫字母可按照上述1進行縮寫，如未經(jīng)菌種確認(rèn)英文縮寫字母則用W.z（未知）代替；其余同上述1，如2012年1月12日第二次傳代的第1支未知野生菌種的編號為：W.z-Y.s-G2-120112-01。5.4菌種的保藏5.4.1標(biāo)準(zhǔn)/標(biāo)準(zhǔn)儲備菌種的保藏采用斜面定期移植法、液體石蠟法、甘油冷凍保藏法、瓷珠保藏法四種方法對我中心各類型標(biāo)準(zhǔn)菌種進行保藏，其詳細(xì)操作見《菌種保藏操作規(guī)程》。5.4.2工作用菌種的保存工作用菌種同《菌種保藏操作規(guī)程》中所述斜面定期移植法。5.4.3菌種的保存方法、條件及期限見《標(biāo)準(zhǔn)儲備菌種保存方法表》。5.5菌種的復(fù)蘇5.5.1標(biāo)準(zhǔn)菌種的復(fù)蘇復(fù)蘇菌種前應(yīng)準(zhǔn)備適于該菌種生長的固體或液體培養(yǎng)基或標(biāo)配菌種復(fù)溶液（稀釋液）以及相應(yīng)的培養(yǎng)設(shè)備，所有操作均應(yīng)在符合生物安全保護及無菌條件下進行。SDB用于黑曲霉、白色念珠菌復(fù)蘇、復(fù)壯，液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基用于生孢梭菌復(fù)蘇、復(fù)壯，營養(yǎng)肉湯或BHI培養(yǎng)基用于金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌、短小芽孢桿菌、銅綠假單胞菌復(fù)蘇、復(fù)壯。5.5.2疫苗瓶開封：拉開易撕鋁蓋，用浸過75%酒精的脫脂棉擦凈丁基膠塞及疫苗瓶。5.5.3加復(fù)溶培養(yǎng)基500μL于標(biāo)準(zhǔn)菌種內(nèi)，待溶解混勻后，用接種環(huán)挑取菌液直接在劃到平皿上，在35-37℃需氧/厭氧條件下培養(yǎng)。（注：干粉型標(biāo)準(zhǔn)菌株加入稀釋液后，宜在30分鐘內(nèi)使用完，不建議再重復(fù)使用）5.5.4若未能活化，或活化后有疑問時，請于收到菌種1個月內(nèi)，通知保藏中心。5.5.5注意事項菌種活化前，請保存在-20℃的環(huán)境下。嗜血桿菌、奈瑟氏菌屬等初代培養(yǎng)需要5-10%CO2環(huán)境，用血平板培養(yǎng)。厭氧菌的培養(yǎng)，如特別說明，自開封至接種完成，均需以無氧氣體充填，以保持厭氧狀態(tài)。某些菌經(jīng)過冷凍干燥保存后，延遲期較長，需連續(xù)兩次繼代培養(yǎng)才能正常生長后使用。5.6標(biāo)準(zhǔn)菌種的確認(rèn)5.6.1用無菌接種環(huán)取上述培養(yǎng)物接種到相應(yīng)的培養(yǎng)基平板上，或相應(yīng)的宜于該菌生長的鑒別培養(yǎng)基平板上，然后在30-36℃下培養(yǎng)3天（細(xì)菌）；23～28℃下培養(yǎng)5天（真菌和酵母菌）。5.6.2培養(yǎng)后，首先觀察其是否具有典型的菌落形態(tài)，然后挑取生長旺盛的單一的純菌落，劃線于平皿培養(yǎng)基，每種菌劃4個平皿，以便收集較多的生長旺盛的典型單菌落，進行保存和確認(rèn)。5.6.3菌種的確認(rèn)結(jié)果，記錄在《標(biāo)準(zhǔn)菌種確認(rèn)記錄表》上。5.7標(biāo)準(zhǔn)菌種傳代5.7.1按菌種說明書要求復(fù)溶菌粉，轉(zhuǎn)接至平板上，并在適當(dāng)溫度下培養(yǎng)適當(dāng)時間，分離單個純種菌落，此為第1代（G1）。5.7.2菌種確認(rèn)后，挑取平板上純菌落制成濃菌懸液用于甘油冷凍管、瓷珠保藏法保存菌種，挑取平板上純菌落用于液體石蠟法、斜面定期移植法保存菌種，以上作為標(biāo)準(zhǔn)儲備菌種（G2），也稱傳代用菌種，同時用濃菌懸液轉(zhuǎn)接斜面菌種數(shù)支，作為工作用菌種，此為第3代（W3）。5.7.3將第2代（G2）菌種管冷凍保存，將工作用菌（W3）于適當(dāng)溫度下培養(yǎng)適當(dāng)時間后用于日常檢驗。5.7.4取一支冷凍保存的第2代（G2）菌種轉(zhuǎn)種于平板和斜面培養(yǎng)基上，平板上的菌種制成冷凍保存管第3代（G3）；斜面培養(yǎng)基的菌種經(jīng)適當(dāng)溫度下培養(yǎng)適當(dāng)時間后用作工作用菌種，此同為第3代（W3）。5.7.5將第3代菌種（G3）冷凍或低溫保存，將生長、轉(zhuǎn)種后的第2代（G2）菌種經(jīng)高溫滅活處理后丟棄。5.7.6按上述規(guī)程操作，直至G4轉(zhuǎn)為W5為止，需重新開啟冷凍干燥菌種，重復(fù)上述規(guī)程操作，保存和使用菌種。5.7.7工作用菌種的傳代當(dāng)工作用菌種代數(shù)小于5時，可直接用上一代工作用菌種轉(zhuǎn)接下一代工作用菌種。取在冰箱2～8℃保存的工作用菌種用普通瓊脂斜面?zhèn)鞔?，并將新傳代的培養(yǎng)物替代原有的菌種，作為工作用菌種。也可取用標(biāo)準(zhǔn)儲備菌種，進行復(fù)蘇，直接作為工作用菌種。傳代時注意無菌操作，并使菌種不死亡，不污染、不丟失。同時實驗人員也要采取有效的預(yù)防措施進行自我保護，如工作時必須穿工作服，佩帶無菌手套，實驗完成以后消毒實驗進行的區(qū)域、實驗儀器和器具。如發(fā)生意外，如菌種泄漏或人員受傷微生物學(xué)檢驗人員應(yīng)立即向科室負(fù)責(zé)人報告以便及時進行處理。5.7.8傳代后，按菌種的編號原則編號，并在每一支菌種管上貼上標(biāo)簽，標(biāo)簽內(nèi)容包括：名稱、編號、代數(shù)、傳代日期、操作人、有效期。交菌種管理員統(tǒng)一保管。同時及時填寫《實驗菌種記錄表》。5.8菌種的保管5.8.1菌種設(shè)專人雙鎖保管，并對所保存的菌種建立《菌種領(lǐng)用登記臺賬》。所保管的菌種，不能隨意轉(zhuǎn)讓其他單位和個人，需要時應(yīng)有單位證明和批準(zhǔn)手續(xù)方可供應(yīng)。5.8.2菌種的期間檢查與鑒定5.8.2.1在菌種的保存期間，應(yīng)每天檢查保存菌種冰箱的溫度并填寫《儀器設(shè)備工作溫度監(jiān)控記錄》。5.8.2.2菌種在保存期內(nèi)均應(yīng)根據(jù)菌種的特性（工作用菌種每轉(zhuǎn)種兩代一次、傳代用菌種每三個月一次）檢查其菌落性狀、革蘭染色、顯微鏡下菌體形態(tài)及生化特性等項目，若發(fā)現(xiàn)與原菌種變異較大，應(yīng)予以重新確認(rèn)并做好《標(biāo)準(zhǔn)菌種確認(rèn)記錄表》。5.8.3菌種的領(lǐng)用與使用微生物檢驗人員根據(jù)檢驗需要，需到菌種管理員領(lǐng)取工作用菌種或標(biāo)準(zhǔn)儲備菌種用于日常檢驗或驗證試驗，同時填寫《菌種領(lǐng)用登記臺賬》。5.9菌種（廢棄）的銷毀5.9.1下列情況的菌種或培養(yǎng)物或被污染的器具等，必須采用121℃、30分鐘濕熱滅活處理：新一代菌種制備成功后的上一代菌種；使用完后的菌種和帶有菌種的器具和培養(yǎng)物；超過有效期的菌種；凡被污染、變異、可疑等異常情況菌種；其他應(yīng)廢棄的菌種。5.9.2廢棄菌種的銷毀由菌種管理員提出申請，交科室