醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)三 考馬斯亮藍(lán)染色法顯示細(xì)胞骨架

實(shí)驗(yàn)三考馬斯亮藍(lán)染色法顯示細(xì)胞骨架實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆湛捡R斯亮藍(lán)染色法顯示細(xì)胞骨架的方法實(shí)驗(yàn)原理細(xì)胞骨架包括：微管、微絲、中間纖維顯示細(xì)胞骨架的方法：考馬斯亮藍(lán)染色法和免疫熒光染色法實(shí)驗(yàn)原理考馬斯亮藍(lán)染色法：去垢劑TritonX-100處理細(xì)胞，可以溶解膜脂，并與大部分非骨架蛋白疏水區(qū)結(jié)合而將其溶解掉，剩下細(xì)胞骨架系統(tǒng)的蛋白不被溶解，然后用蛋白染料考馬斯亮藍(lán)染色即可顯示細(xì)胞骨架。實(shí)驗(yàn)原理考馬斯亮藍(lán)R250(coomassiebrilliantblueR250）該染料每分子含有2個(gè)SO3H基團(tuán)，偏酸性，結(jié)合在蛋白質(zhì)的堿性基團(tuán)上，且染料的苯環(huán)與芳香族氨基酸結(jié)合器具及試劑材料：貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞M緩沖液、磷酸緩沖液、TritonX-100、戊二醛、考馬斯亮藍(lán)染液R250實(shí)驗(yàn)步驟1、將細(xì)胞培養(yǎng)在蓋玻片上。取出蓋玻片，用PBS洗3次。

注意洗片時(shí)，不要對(duì)著片上的細(xì)胞直接沖洗，以免將細(xì)胞沖走。實(shí)驗(yàn)步驟2、室溫下用1%TritonX-100處理20～30min。

TritonX-100（聚乙二醇辛基苯基醚)：一種非離子型表面活性劑，它能溶解脂質(zhì)，以增細(xì)胞膜的通透性。實(shí)驗(yàn)步驟3、用M緩沖液輕輕洗細(xì)胞3次

M緩沖液配方：咪唑50mmol/L；KCl50mmol/L；MgCl20.5mmol/L；EGTA1mmol/L；EDTA0.1mmol/L；巰基乙醇或二硫蘇糖醇（DTT）1mmol/L；用1mol/L鹽酸調(diào)pH至7.2

各成分作用是什么？實(shí)驗(yàn)步驟4、用3.0%戊二醛固定細(xì)胞10min。戊二醛（glutaraldehyde），含兩個(gè)活潑的醛基，是一種雙交聯(lián)劑，兩個(gè)醛基分別可以通過與相鄰的另一氨基反應(yīng)，產(chǎn)生較強(qiáng)的交聯(lián)作用。戊二醛對(duì)蛋白質(zhì)的固定效果好，且不破壞細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)步驟5、用PBS洗三次，濾紙吸干。實(shí)驗(yàn)步驟6、用0.2%考馬斯亮藍(lán)R250染色30min。蒸餾水沖洗，在空氣中自然晾干。實(shí)驗(yàn)步驟7、在光學(xué)顯微鏡下觀察，可看到細(xì)胞骨架主要沿著細(xì)胞生長(zhǎng)長(zhǎng)軸成極性分布。思考題1、考馬斯亮藍(lán)染色法顯