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文檔簡介
第三節(jié)載體一.載體的概念:1.要把一個有用的基因(目的基因——研究或應用基因)通過基因工程手段送到生物細胞(受體細胞),需要運載工具(交通工具)攜帶外源基因進入受體細胞,這種運載工具就叫做載體(vector)。2.凡來源于質?;蚴删w的DNA分子,可以插入或克隆DNA片段統(tǒng)稱為vector。3.基因工程所用的vector實際上是DNA分子,是用來攜帶目的基因片段進入受體細胞的DNA二、載體的分類分類依據(jù)類別克隆擴增或表達舉例1.按功能分成(1)克隆載體(2)表達載體√√PBR322PCDN32.按進入受體細胞類型分(1)原核載體(2)真核載體(3)穿梭載體PUC8PBUDCE41YE3.按載體來源分病毒載體+4.按克隆片段得大?。寺∧芰Γ┓?1)<1kb(2)<10kb(3)<22kb(4)<50kb(5)0.1-0.4Mb(6)0.5-2Mb(1)M13(2)plasmid(3)λphage(4)casmid(5)BAC(6)YAC√三、基因工程載體的3個特點:(一)能獨立自主的復制
載體DNA分子中有一段不影響它們擴增的非必需區(qū)域,如MCS,插在其中的外源DNA片段,能被動的跟著載體一起復制/擴增,就像載體的正常成分一樣。(二)能便利的加以檢測
如載體的藥物抗性基因,多是抗生素抗性基因,將受體細胞放在含有該抗生素培養(yǎng)板上培養(yǎng)生長時,只有攜帶這些抗性基因的載體分子的受體細胞才能存活。(三)都能容易進入宿主細胞中去,也易從宿主細胞中分離純化出來。
四載體舉例介紹1.
質粒載體:
(1)染色體外的雙鏈環(huán)狀DNA分子(2)大小為1~200kb;(3)能獨立于染色體外進行自我復制,每個細胞中可含10~200個拷貝。(4)分高拷貝數(shù)和低拷貝數(shù)質?;蛘拗鞣秶蛷V宿主范圍(5)質粒包含:復制起始區(qū)、選擇標記基因和限制性核酸內切酶的酶切位點常用質粒有:pBR322、pUC19質粒的不相容性:同種的或親緣關系相近的兩種質粒不能同時穩(wěn)定地保持在一個細胞內的現(xiàn)象
(一)大腸桿菌載體Ampr→LacZoriop2.噬菌體載體
什么是噬菌體:噬菌體感染細菌后會出現(xiàn)什么現(xiàn)象烈性噬菌體和溫和噬菌體:溶原和溶菌(一)大腸桿菌載體入-噬菌體DNA長度約為48.5kb(分子量3.2×107)在病毒顆粒中為雙鏈線形分子具有12bp的粘性末端(cohesiveend),進入大腸桿菌之后立即互補成環(huán)。Cos位點:當λDNA進入細菌細胞后,便迅速通過黏性末端配對形成雙鏈環(huán)狀的DNA分子,這種黏性末端結合形成雙鏈的區(qū)域稱為cos位點。
λ-噬菌體結構特點:1、野生型為48.5kb,兩端帶有12堿基的單鏈粘性末端,進入大腸桿菌后環(huán)化,既可溶菌又可溶原生長。2、基因組分為三個區(qū)域:左側區(qū)包括使噬菌體成熟的全部基因;中間區(qū)不是病毒生活必需的,外源DNA片段往往插入此區(qū);右側區(qū)包括所有的主要調控成分。3、λ-噬菌體基因組中只有60%是溶菌生長必需的,作為克隆載體時,可插入9~23kb的外源DNA片段。(一)大腸桿菌載體λ重組分子的選擇主要有下面幾種方法。
①cI基因功能選擇--cI基因編碼的阻遏蛋白可使感染了λ噬菌體的大腸桿菌進入溶原化狀態(tài)。如果在插入型載體的克隆位點上,或是置換型載體的可置換片段中,放上一個cI基因,當外源DNA插入或取代時,便破壞了cI基因,使出現(xiàn)cI-表型。此時,λ重組分子生成的是透亮的噬菌斑,而未重組的λ噬菌體由于仍保有cI基因,所以宿主細菌是溶原化的,就生成混沌的噬菌斑。
②lacZ基因功能選擇----lacZ基因的產(chǎn)物為乳糖苷酶,在Xgal—IPTG培養(yǎng)基上顯現(xiàn)藍色。在插入型載體的lacZ基因序列中引入限制性內切核酸酶的切點,外源DNA插入這個克隆位點就會破壞lacZ基因,于是在上述培養(yǎng)基上出現(xiàn)無色的噬菌斑。如果沒有同外源DNA形成λ重組分子,則lacZ基因未遭破壞,在培養(yǎng)基上出現(xiàn)藍色的噬菌斑。
③spi-選擇λ噬菌體的red和gam基因產(chǎn)物可抑制噬菌體在宿主細菌中正常生長,red-和gam-突變型λ噬菌體則可正常生長。當置換型載體的可置換片段中放上red和gam基因后,外源DNA片段取代了置換片段,則同時除去了red、gam基因,就可在宿主菌中生長,否則就不能正常生長。
3.柯氏質粒/粘尾質粒(cosmid)定義:含有入噬菌體粘性末端的復合質粒。由入-DNAcos區(qū)與質粒重組建造而成.在宿主細胞中可以作為正常噬菌體進行復制,但不表達噬菌體的任何功能。
(一)大腸桿菌載體柯氏質粒特點①含有質粒的抗藥性標記如Ampr基因或Tetr基因及自主復制成分,所以這種粘性質??梢栽诩毦写罅繌椭茢U增。當體外重組的粘性質粒分子包裝成噬菌體顆粒并感染大腸桿菌后,可按質粒的方式進行復制。②帶有噬菌體的粘性末端(cos區(qū))。這一粘性末端是體外包裝系統(tǒng)必不可少的成分,所
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