第5章 將DNA引入活

第五章將DNA引入活細胞（受體細胞）受體細胞：從實驗技術(shù)上講是能攝取外源DNA并使其穩(wěn)定維持的細胞。從實驗?zāi)康纳现v是有應(yīng)用價值和理論研究價值的細胞。受體細胞的選擇所遵循的原則：1）便于重組DNA的導(dǎo)入2）能使重組DNA穩(wěn)定的存在于細胞中。3）便于重組體的選擇。4）遺傳穩(wěn)定性高。5）安全性高，無致病性。6）受體細胞在遺傳密碼的應(yīng)用上無明顯的偏好。重組DNA分子引入活細胞，隨著活細胞的生長和分裂產(chǎn)生克隆克隆的目的A)產(chǎn)生大量的重組DNA分子B）純化目的分子連接產(chǎn)物中包含的分子類型：未連接的載體分子未連接的DNA分子自連的載體分子重組的DNA分子攜帶插入錯誤DNA片段的重組分子5.1轉(zhuǎn)化—使細菌細胞獲取DNA轉(zhuǎn)化：指重組質(zhì)粒DNA分子通過與膜蛋白結(jié)合進入受體細胞，并在受體細胞內(nèi)穩(wěn)定維持與表達的過程。5.1.1不同種類的細菌獲取DNA的效率不同自然條件中，外源DNA被細菌吸收后，會被降解1)裸露的線性DNA分子，易遭到核酸酶的攻擊2）細菌細胞具有修飾限制系統(tǒng)，識別自我和非我的DNA分子正常狀態(tài)下的細菌細胞獲取外源DNA的能力有限5.1.2大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備過冷的鹽處理的大腸桿菌的細胞比未處理的細胞獲取外源DNA的能力要高。感受態(tài)細胞：經(jīng)過一些物理或化學處理后，具備增強了獲取外源DNA能力的細胞，稱為感受態(tài)細胞。感受態(tài)細胞能增強獲取外源DNA能力的可能機理：Ca2+離子與細胞膜磷脂層形成液晶結(jié)構(gòu)、促使內(nèi)外膜之間核酸酶解離形成感受態(tài)。Ca2+離子能與DNA結(jié)合形成形成羥基——磷酸鈣復(fù)合物（抵抗DNAase）并能吸附在細胞外膜表面上。熱擊破壞液晶結(jié)構(gòu)，細胞膜結(jié)構(gòu)出現(xiàn)間隙，為DNA分子提供進入細胞的通道。5.1.3對轉(zhuǎn)化細胞的選擇

（含目標質(zhì)粒的細胞）通過質(zhì)粒所攜帶基因的表達情況來進行檢測大都數(shù)的質(zhì)?？寺≥d體賦予寄主細胞耐受抗生素的表型，通過寄主細胞獲得的表型來進行篩選細胞轉(zhuǎn)化后的復(fù)蘇階段的目的：培養(yǎng)細胞產(chǎn)生足夠多的分解抗生素的產(chǎn)物，利于后續(xù)的在平板中的生長。5.2重組體的鑒定轉(zhuǎn)化子：導(dǎo)入外源DNA后能穩(wěn)定存在的受體細胞。重組子：含有重組DNA分子的轉(zhuǎn)化子。陽性克?。汉心康腄NA的重組子。通過各種方法將DNA導(dǎo)入受體細胞后，獲得所需陽性克隆的過程稱為篩選。通過載體上攜帶的基因特點來進行篩選：如抗性標記、插入失活、插入表達、顏色互補等。5.2.1pBR322重組體的篩選—抗生素抗性基因的插入失活在BamHI位點插入外源DNA分子，就不再賦予寄主細胞耐受四環(huán)素的性質(zhì)重組的pBR322分子保持氨芐青霉素抗性，為ampRterr篩選重組的pBR322分子的方法（p83）缺點：需要兩輪篩選5.2.2α互補

（藍白斑篩選，LacZ互補）正常野生型的大腸桿菌編碼能利用乳糖的基因，包含LacZ基因，編碼?-半乳糖苷酶（乳糖操縱子的結(jié)構(gòu)）基因工程的工程菌通常將該基因修飾，使其缺少編碼?-半乳糖苷酶α-肽段的序列在載體上加入一段含編碼?-半乳糖苷酶α-肽段LacZ’基因如果載體上的LacZ’基因不被破壞（未插入外源DNA分子），通過載體與宿主細胞中兩段基因產(chǎn)物的互補，可形成有活性的?-半乳糖苷酶5.2.2α互補

（藍白斑篩選，LacZ互補）在實驗過程中，加入乳糖類似物X-gal，被?-半乳糖苷酶分解可產(chǎn)生藍色的化合物由于載體上具有抗生素抗性基因，賦予了宿主細胞抗生素抗性能力，因此在這類的克隆中？當載體上的LacZ’基因被破壞（插入了外源DNA分子），不能形成有活性的?-半乳糖苷酶，因此在這類克隆中具備？5.2.2α互補

（藍白斑篩選，LacZ互補）α互補（藍白斑篩選，LacZ互補）5.3將噬菌體DNA引入細菌細胞5.3.1轉(zhuǎn)染(transfection):類似質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化，將重組的λ噬菌體DNA分子導(dǎo)入到受體細胞內(nèi)并穩(wěn)定遺傳的過程。5.3.2λ克隆載體的體外包裝體外包裝：模擬λ噬菌體DNA分子在宿主細胞內(nèi)發(fā)生的包裝過程，將重組的λ噬菌體DNA分子包裝成成熟的具有感染能力的λ噬菌體顆粒必要性：λ噬菌體重組分子直接感染大腸桿菌的效率較低，而在試驗過程中，因內(nèi)切酶的處理，DNA的連接產(chǎn)生的有效分子等原因，使得轉(zhuǎn)染效率更低5.3.2λ克隆載