細胞生物學(xué)技術(shù)：細胞生物學(xué)新技術(shù)簡

細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究技術(shù)(2)2015.12

His-Cax-+-+HA-p65--++

IP:Anti-HisIB:Anti-HA

Anti-His

Anti-HA

IP:Anti-HAIB:Anti-HisTotalcelllysates1234InVivoBindingAssay

(Co-mmunoprecipitation,CoIP)(免疫共沉淀)proteinA-agarosebeadsHA-p65Anti-His-IgGProteinAHis-Caxagarosebeads有時侯，抗體可以直接偶聯(lián)到agarosebeads上Anti-HA-IgGHis-CaxHA-p65agarosebeadsMNO現(xiàn)在我們有足夠的證據(jù)表明，p65是Cax的相互作用蛋白p65是轉(zhuǎn)錄因子NF–κB的一個亞基，NF–κB已經(jīng)得到廣泛深入的研究。下一步的研究應(yīng)該是Cax是否參與調(diào)節(jié)NF–κB的活性，如何調(diào)節(jié)？NF-κB的激活

轉(zhuǎn)錄因子(transcriptionfactor)在GPCR途徑中有CREB酶偶聯(lián)受體：

RTK-Ras-MAPK途徑中有cMyc,cJun,cFos

其他：STAT、Smad在受調(diào)蛋白水解依賴的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中有NF-κB

在核受體信號途徑中,核受體自身為轉(zhuǎn)錄因子。

轉(zhuǎn)錄因子就是基因調(diào)控蛋白，通過與DNA上基因調(diào)控序列結(jié)合，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。在研究某些因素對NF–κB信號系統(tǒng)的影響的時候，分為不同層次：細胞質(zhì)層次：

IκB激酶的激活（kinaseassay)IκB的降解(Westernblot)細胞核層次：NF–κB與DNA的結(jié)合能力（invitro)（EMSA)NF–κB與DNA的結(jié)合（invivo)(ChIP)NF–κB與co-activator或co-repressor的關(guān)系05101530600510153060min

VectorHis-CaxIκBα(37KD)β-actinCax對IκB降解的影響(Westernblot)制備穩(wěn)定表達Cax的細胞系：逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或pcDNA3G418篩選TNFα抗原等蛋白樣品經(jīng)SDS處理后全部帶上負電荷，從而使蛋白之間僅有分子大小的差異。將少量待測蛋白樣本加入夾在兩塊玻璃平板之間的聚丙烯酰酰凝膠頂部的加樣孔中。組織或細胞的蛋白裂解產(chǎn)物凝膠玻璃平板將凝膠置于電場中，凝膠的底部接正極。帶負電荷的蛋白向凝膠底部的正極泳動，并按分子大小的不同形成分離的條帶。蛋白分子的泳動速率與分子的大小成反比，最小的多肽最先到達凝膠的底部。凝膠可以用能結(jié)合多肽的染液進行染色。最終在凝膠中顯示樣本中各多肽的位置。BlottingUsedtoidentifyasingleprotein/DNA/RNAmoleculeinacomplexmixturethathasbeenseparatedbygelelectrophoresisProbesarelabeledforeasyvisualizationWhenantibodiesareusedtoprobeforspecificproteinsinagel,thisiscalled“westernblotting”SouthernblottingisprobingforaDNAsequencewithaDNAprobeNorthernblottingisprobingforanRNAsequencewithaDNAprobeAntibodiesProteinsthatplayacriticalroleinhumoralimmunityTocellbiologists,theyare“tools”forresearchHighlyselectiveforspecificmoleculesEasytopurifyEasytochemicallymodifywith“tags”thatcanbevisualizedCansometimesimpactthefunctionofaproteininalivingcell(e.g.,herceptin)Polyclonalantibodies次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶（HGPRT）胸腺嘧啶核苷激酶（TK）次黃嘌呤（hypoxanthine,H）氨甲喋呤（aminopterin,A）胸腺嘧啶核苷（thymidine,T）氨甲喋呤是葉酸的拮抗劑DAPIHis-Cax

Anti-His免疫熒光：p65可能位于細胞核或細胞質(zhì)，那么Cax定位于哪里呢？亞細胞定位帶標簽的重組蛋白重組蛋白His-tagHA-tag共定位重組DNA技術(shù)ＧＡＡＴＴＣＡＴＧＣＴＴＡＡＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＡＴＴＣＸＹＡＴＧCax與p65的細胞核共定位:TNFalpha處理2小時

Anti-p65

Anti-PML

Anti-Cax

Anti-Cax

Merge

MergeP65與Cax共定位于細胞核內(nèi)對NF-kB的功能有何影響？

轉(zhuǎn)錄因子受到co-activator或co-repressor的調(diào)節(jié)，可以引起染色體重構(gòu)，從而改變核小體的局部構(gòu)象，使得轉(zhuǎn)錄復(fù)合體易于或不易于接近轉(zhuǎn)錄起始點。?Cax很可能是NF–κB的共激活因子（co-activator)或共抑制因子(co-repressor)用報告基因來檢測轉(zhuǎn)錄因子的活化：綠色熒光蛋白2.半乳糖苷酶

3.熒光素酶(Luciferase)TitrationHis-CaxJ16Cax抑制NF–κB的轉(zhuǎn)錄活性5’-deletionanalysiscanidentifytranscription-controlsequencesinDNAupstreamofageneIFN-

、IFN-

可誘導(dǎo)胚胎成纖維細胞CAX的表達RT-PCR結(jié)果1000U/mlIFN-

M--+/+c6h12h24h-/-cG3PDHmCAXNorthern100U/mlIFN-

C6h12h24hC6h12h24hG3PDHmCAX+/+-/-Anelectrophoreticmobilityshiftassay(EMSA),alsoreferredasagelshiftassay,gelmobilityshiftassay,isacommontechniqueusedtostudyprotein-DNAorprotein-RNAinteractions.ThisprocedurecandetermineifaproteinormixtureofproteinsiscapableofbindingtoagivenDNAorRNAsequence,andcansometimesindicateifmorethanoneproteinmoleculeisinvolvedinthebindingcomplex.

p65NFκBbindingsites凝膠電泳遷移率變遷分析（Electrophoreticmobilityshiftassay,EMSA）

，也稱GelShift。檢測轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合的能力（invitro)：檢測轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合的能力（invitro)：凝膠電泳遷移率變遷分析（Electrophoreticmobilityshiftassay,EMSA）

，也稱GelShift。TNFα-+-+

NF-κBFreeprobeVectorHis-CaxCax不影響NFκB與DNA結(jié)合的能力（DNAbindingcapacity）核蛋白粗提物32P標記NF-κB探針1與2孵育,SDS,放射自顯影檢測轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合的能力（invitro)：凝膠電泳遷移率變遷分析（Electrophoreticmobilityshiftassay,EMSA）

，也稱GelShift。

凝膠電泳遷移率改變分析（EMSA）是目前研究轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白和相應(yīng)核苷酸序列結(jié)合的常用方法，但是由于許多轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白有相似或相同的DNA結(jié)合位點，這種體外分析獲取的結(jié)果不一定能真實地反映體內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白和DNA結(jié)合的狀況。染色質(zhì)免疫沉淀分析（ChIP）是基于體內(nèi)分析發(fā)展起來的方法，它能真實、完整地反映結(jié)合在DNA序列上的調(diào)控蛋白，是目前確定與特定蛋白結(jié)合的基因組區(qū)域或確定與特定基因組區(qū)域結(jié)合的蛋白質(zhì)的最好方法。染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（chromatinimmunoprecipitationassay,CHIP）

研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法。它的基本原理是在活細胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)－DNA復(fù)合物，并將其隨機切斷為一定長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后通過免疫學(xué)方法沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，通過對目的片斷的純化與檢測，從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。該技術(shù)主要應(yīng)用：1.組蛋白修飾研究2.轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析3.藥物開發(fā)研究4.有絲分裂研究5.DNA損失與凋亡分析。下圖是ChIP技術(shù)的作用原理。=p65IntactcellCrosslinkwithformaldehydeHarvestcellsSonicatetofragmentchromatinReversecrosslinkingbyheatingat65°CovernightanduseRNAseandproteinaseKtodegradeproteinandRNACheckfragmentationbyrunninganagarosegelDividechromatininto3aliquots:(1)input,(2)IPwithIgG,(3)IPwithp65antibodyPerformIP活細胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)－DNA復(fù)合物將其隨機切斷免疫學(xué)方法沉淀Reversecrosslinkingbyheatingat65°CovernightUseRNAseandproteinaseKtodegradeproteinandRNAPurifyDNAandrunPCRontargetsequences(cyclinD)RunSDStocheckifproteinwasprecipitatedbytheantibodyspecificallyinputIgGp65IgGp65inputIgGp65Positiveprimer檢測轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合（invivo)：染色體免疫沉淀（chromotinimmunoprecipitation,ChIP）

InputAntip65

His-Cax

cyclinD1promoter

cyclinD1promoter

VectorIgGCax不影響NFκB與DNA的結(jié)合（DNAbinding）Anti-p65-IgGp65NFκBbindingsites

cyclinD1promoterChromotinprocessingtosmallfragments(500-600bp)Anti-p65immunoprecipitationPCRforcyclinD1promoter(containingNFκBbindingsites)細胞質(zhì)層次：

IκB激酶的激活（kinaseassay)IκB的降解(Westernblot)細胞核層次：NF–κB與DNA的結(jié)合能力（invitro)（EMSA)NF–κB與DNA的結(jié)合（invivo)(ChIP)Cax對NF–κB信號系統(tǒng)的影響作用環(huán)節(jié)可能在co-repressor

共激活因子（co-activator)或共抑制因子(co-repressor)往往就是通過調(diào)節(jié)組蛋白的翻譯后修飾實現(xiàn)其功能的組蛋白可以有多種翻譯后修飾形式：

磷酸化乙酰化泛素化甲基化這些修飾會影響組蛋白的構(gòu)象，從而影響轉(zhuǎn)錄復(fù)合體與DNA的結(jié)合：Histonecode引起染色體重構(gòu)(Remodeling)的因子：ATP-dependantRemodelingComplexesHATorHDACComplexesHAT:histoneacetyltransferase（組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶）

HDAC:histonedeacetylase（組蛋白脫乙酰酶）His-CaxHis-CaxTSA，不影響Cax對NFκB的抑制作用；NAM,可解除Cax對NFκB的抑制作用。

TSA，第一、二類組蛋白脫乙酰酶（HDAC）的抑制劑；NAM,第三類HDAC的抑制劑。Cax是依賴于第三類HDAC活性的co-repressorHela細胞，anti-His純化Cax體外表達GST-Cax,無HDAC活性Cax可募集HDAC活性（Recruitsdeactylaseactivity)CAX——HDAC活性？Anti-SIRT1Anti-HisAnti-SIRT1IPwithanti-HisTotalcelllysateVectorHis-CaxCax可募集第三類HDAC

SIRT1p50p65p50p65SIRT1CaxSIRT1藥物A

已知NFκB有對抗細胞凋亡的作用，目前數(shù)據(jù)提示Cax可能通過抑制NFκB的活化，從而具有促進細胞凋亡的作用要證實這一點，需對細胞內(nèi)Cax的水平進行干預(yù)，考察NFκB活化和細胞凋亡的情況干預(yù)方法：正：過度表達

負：siRNADominantNegativeMutant當(dāng)然，也可以制備Cax轉(zhuǎn)基因小鼠或Cax基因剔除小鼠DominantNegativeMutant(負顯性突變)：對影響蛋白質(zhì)功能的關(guān)鍵位點進行突變，所得突變體不僅喪失了原有功能，并且可以抑制內(nèi)源性蛋白質(zhì)的功能。例如，對Cax和SIRT1的結(jié)合位點進行研究后，發(fā)現(xiàn)某個位點的氨基酸對Cax募集SIRT1的功能非常重要，該氨基酸突變后，Cax喪失了募集SIRT1的功能。進一步研究發(fā)現(xiàn)，CaxM具有負顯性功能，可促進NF–κB的激活,其機制可能是對內(nèi)源性Cax的競爭性抑制。Anti-SIRT1Anti-HisAnti-SIRT1IPwithanti-HisTotalcelllysateVectorHis-CaxHis-CaxM

ControlTNF

Luciferaseactivity(fold)VectorHis-CaxHis-CaxMp50p65p50p65SIRT1內(nèi)源性CaxSIRT1外源性CaxM內(nèi)源性Cax?siRNA(smallinterferingRNA)或RNAi(RNAinterference)的原理siRNA的設(shè)計:可進入各生物公司網(wǎng)站在線設(shè)計或請專業(yè)公司設(shè)計siRNA如何轉(zhuǎn)入細胞:瞬時和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染siRNA效果鑒定:NorthernBlot或WesternBlotCax沉默促進由TNFalpha刺激引起的NFκB-依賴的轉(zhuǎn)錄CaxAnnexinV-FITCPIControl藥物A+化療藥

CaxsiRNA

ControlsiRNACaxsilencingdecreasestheapoptoticcellsp50p65SIRT1內(nèi)源性CaxCaxreconstitutioncouldrescuetheapoptoticsusceptibilityofcellstoTNF

Cax*isresistantfordegradationinducedbysiRNA.ItssequencehasmultiplenucleotidesubstitutionswithinthesiRNAbindingsite,butretainthecodingofidenticalaminoacidsasthewildtypeCax,toallowforreconstitutioninthesiRNAenvironmentHis-Cax*Anti-His

WT:5’CAAAGCGTGGACCTGGTCTTCCCT3’;Mutant:5’CAgtcCGTaGattTaGTaTTtCCg3’

forthesameaminoacidssequence:QSVDLVFP

現(xiàn)在我們可以得出結(jié)論:1.Cax具有促進細胞凋亡的作用2.藥物A通過誘導(dǎo)Cax表達的增加,增強腫瘤細胞對化療誘導(dǎo)凋亡的敏感性3.Cax促進細胞凋亡的機制可能是抑制了NFκB的激活研究蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)的活動情況需要從哪些方面入手？通常有哪些實驗手段可以用來研究蛋白和蛋白的相互作用？通常有哪些實驗手段可以用來研究蛋白和DNA的相互作用？何為報告基因?其有哪些研究用途？可用哪些技術(shù)對細胞內(nèi)某個蛋白的水平進行干預(yù)?它們有什么區(qū)別?負顯性突變：對影響蛋白質(zhì)功能的關(guān)鍵位點進行突變，所得突變體不僅喪失了原有功能，并且可以抑制內(nèi)源性蛋白質(zhì)的功能。DNAmicroarray：是一種用于分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的高通量技術(shù).它由一系列成千上萬個精微的DNA寡核苷酸點排列而成，這些DNA寡核苷酸含有百億分之一摩爾特定序列的。它們或者是一小截基因，或者是DNA的其他成分。它們被作為探針，在非常嚴格的條件下和一個叫做靶分子的cDNA或cRNA樣本雜交。由于靶分子帶有熒光標記，因此通過探針-靶分子的雜交，并根據(jù)雜交后熒光的有或無，強或弱，對靶分子中特定核酸序列的豐度進行檢測。共激活因子：是一種蛋白，本身不能與DNA結(jié)合，但能夠通過與具有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的激活因子（或轉(zhuǎn)錄因子）結(jié)合來增強基因的表達。共激活因子可調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的許多其他過程，如轉(zhuǎn)錄的延長、終止、RNA剪接以及激活因子和共激活因子復(fù)合體的降解等。報告基因:是一種編碼可被檢測的蛋白質(zhì)或酶的基因，也就是說，是一個其表達產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因。把它的編碼序列和基因表達調(diào)節(jié)序列相融合形成嵌合基因，或與其它目的基因相融合，在調(diào)控序列控制下進行表達，從而利用它的表達產(chǎn)物來標定目的基因的表達調(diào)控。

染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù):研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法。它的基本原理是在活細胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)－DNA復(fù)合物，并將其隨機切斷為一定長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后通過免