馬鈴薯solaumulerisuml抗寒性的鑒定

馬鈴薯solaumulerisuml抗寒性的鑒定

中國(guó)南方的秋天和冬季氣候適合生長(zhǎng)阻止栽培。據(jù)預(yù)測(cè),南方冬作農(nóng)田至少可發(fā)展400萬(wàn)hm2馬鈴薯,新增食物6000萬(wàn)t,可滿足1億人300d的食物供應(yīng)。秋、冬季種植馬鈴薯還可調(diào)節(jié)上市時(shí)間,提高銷售價(jià)格,經(jīng)濟(jì)效益遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過種植一般的冬季作物。貴州冬閑田有約70萬(wàn)hm2,有很大的發(fā)展空間。但在南方發(fā)展秋、冬種馬鈴薯最主要的問題是低溫寒凍的影響。尤其是近年來,冬末春初寒流引起的風(fēng)雪凍雨天氣和輻射冷卻造成的霜凍時(shí)有發(fā)生,如在2008年的特大低溫霜凍災(zāi)害中,南方各地的馬鈴薯受災(zāi)面積達(dá)到40.93萬(wàn)hm2左右,造成的直接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)10億元,給馬鈴薯生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2~3]。馬鈴薯普通栽培種出苗后遇<7℃的低溫植株停止生長(zhǎng),-0.8℃時(shí)遭受冷害,-1.5℃時(shí)遭受凍害、-3℃時(shí)凍死;野生種(Solanumacaule)一般在-4℃處理12h后才出現(xiàn)嚴(yán)重凍傷或死亡。但由于倍性原因,通過常規(guī)雜交方式難以將抗寒能力轉(zhuǎn)移到普通栽培種中。目前,大田生產(chǎn)中馬鈴薯凍害預(yù)防的主要措施是利用秸稈、培土、熏煙和地膜覆蓋等提高地溫,這些措施均有一定的效果。但在面積大、低溫災(zāi)害頻繁的情況下,難以使用這些方法;即使在小面積范圍內(nèi)實(shí)施這些措施,也因投入的人力和物力提高了成本,嚴(yán)重影響了馬鈴薯的經(jīng)濟(jì)效益和產(chǎn)業(yè)發(fā)展。因此,選育馬鈴薯抗寒品種在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有實(shí)際的作用和意義。馬鈴薯主要是以塊莖無性繁殖為主,在栽培過程中,自然變異時(shí)有發(fā)生,變異性狀可通過無性繁殖保存下來,因此馬鈴薯品種、尤其是地方品種的雜合度很高。同時(shí),通過輻射也可使馬鈴薯產(chǎn)生表型和DNA水平上的變異,從而在抗性方面改變。因此,在自然和輻射變異群體中鑒選抗寒性強(qiáng)的材料,是抗寒育種的方法之一。目前對(duì)馬鈴薯的抗寒材料的研究主要集中在苗期的耐凍機(jī)理,而在抗寒性鑒定的方法方面鮮見報(bào)道。植物抗寒性鑒定的主要方法有生理生化指標(biāo)檢測(cè)(包括電解質(zhì)滲透率檢測(cè)、SOD和POD等抗氧化酶活性檢測(cè))、田間自然霜凍鑒定、室內(nèi)人工低溫脅迫等。低溫引起的細(xì)胞器膜結(jié)構(gòu)的破壞是導(dǎo)致植株寒害損傷和死亡的根本原因。隨著溫度的降低,馬鈴薯葉片發(fā)生質(zhì)壁分離,當(dāng)溫度降到-12℃時(shí),能明顯觀察到胞內(nèi)結(jié)冰,葉片呈黑褐色。通過測(cè)量電導(dǎo)率可評(píng)價(jià)馬鈴薯的耐凍性,馬鈴薯葉片質(zhì)膜透性越大,電導(dǎo)率愈大,耐凍性越差。植物抗氧化性也是增強(qiáng)其抗逆性的一個(gè)關(guān)鍵因素,是植物對(duì)低溫逆境的應(yīng)激反應(yīng)[6~8]。筆者利用電解質(zhì)滲透率的測(cè)定、SOD酶活性測(cè)定、離體葉片低溫脅迫鑒定3種方法對(duì)地方品種普安紫洋芋、田間自然變異的抗寒株系和輻射變異株系進(jìn)行抗寒性檢測(cè),期望能篩選出抗寒能力強(qiáng)的材料供育種所用。1材料和方法1.1費(fèi)烏瑞系5d3-33x普安紫洋芋是普安紫色紫肉的地方品種,由普安縣扶貧辦供種。Ⅲ-25-5在2010年冬經(jīng)歷了田間7次0℃、3次-2℃、3次-4℃自然霜凍條件后全田唯一存活的費(fèi)烏瑞它自然變異抗寒株系;3-23X是費(fèi)烏瑞它經(jīng)過60Gy輻射處理的VM4代變異株系。費(fèi)烏瑞它是由中國(guó)農(nóng)科院蔬菜花卉研究所提供。1.2方法1.2.1系及其ck的靜置時(shí)間隨機(jī)選取整株普安紫洋芋15株,分成常溫CK、4℃(12h)、0℃(12h)3個(gè)處理,低溫處理在低溫展示柜中進(jìn)行。每個(gè)處理5株,每株取葉片3份,每份0.5g。費(fèi)烏瑞它2個(gè)變異株系及其CK也分成3組:常溫CK、4℃(12h)、-3℃(12h)。每個(gè)處理5株,每株取葉片3份,每份0.5g。電解質(zhì)滲透率的測(cè)定參照丁燦的方法加以改進(jìn)。將處理后的樣品放入試管中,加入20mL無離子水,整株普安紫洋芋、費(fèi)烏瑞它2個(gè)變異株系及其CK的靜置時(shí)間分別為12、18h;用DDS-307A型電導(dǎo)儀分別測(cè)定樣品浸出液的電導(dǎo)率;然后將樣品放入水浴鍋中煮沸30min后再靜置12h,然后測(cè)定浸出液電導(dǎo)率,根據(jù)公式電解質(zhì)外滲率=煮前電導(dǎo)率/煮后電導(dǎo)率×100%計(jì)算電解質(zhì)的外滲率后比較分析。1.2.2sod粗酶液的提取采用檢測(cè)過滲透率的費(fèi)烏瑞它2個(gè)變異株系及其CK再進(jìn)行SOD酶活性測(cè)定,比較2種方法的差異。隨機(jī)選取3株進(jìn)行SOD檢測(cè),每株取葉片2份,每份0.2g,然后分為對(duì)照和處理2個(gè)組,CK組置于常溫下,處理組在4℃環(huán)境中馴化24h后再放在-3℃溫度下處理24h。SOD粗酶液的提取參照戴獻(xiàn)英的方法并稍有修改。將經(jīng)過處理的材料放入研缽中,加入少量預(yù)冷的pH8.2的Tris緩沖液冰浴研磨,將勻漿液在4000r/min下離心20min。取上清液,于60℃水浴鍋中15min,冷卻后于4000r/min離心20min,取上清液,加入緩沖液并定容至10mL,獲得樣品的SOD粗酶液。將緩沖液、鄰苯三酚溶液SOD粗酶液放入25℃的水浴鍋中預(yù)熱25min;取預(yù)熱的緩沖液300μl,再加入SOD粗酶液10μl和鄰苯三酚溶液20μl,傾入比色杯中,迅速搖勻,在波長(zhǎng)325nm處從每隔30s測(cè)定吸光度一次,一共測(cè)定5次,然后取平均值。鄰苯三酚自氧化測(cè)定與SOD酶活性測(cè)定步驟相同。1.2.3微生物異質(zhì)材料3-33x及其ck試驗(yàn)1:選取費(fèi)烏瑞它自然變異株系2個(gè)(單株Ⅲ-25-51(1)、Ⅲ-25-52(2),圓圈內(nèi)數(shù)字為單株序號(hào))及其CK(Ⅲ-25-5CK4(4),Ⅲ-25-5CK2(2)),費(fèi)烏瑞它輻射變異株系2個(gè)單株3-23X4(4)、3-23X10(10)及其CK(3-237(7)、3-238(8)),每株各取2~8位羽葉的頂部葉片2片放入塑料培養(yǎng)盒,隨機(jī)放置在展示柜中,按表1的溫度和時(shí)間進(jìn)行處理,根據(jù)葉片的存活狀況鑒定參試材料的抗寒能力。試驗(yàn)2:由于試驗(yàn)1中3-23X及其CK葉片存活率均為100%,考慮到試驗(yàn)1采用塑料培養(yǎng)盒可能對(duì)葉片起了一定的保護(hù)作用,因此將費(fèi)烏瑞它輻射變異株系3-23X(3-23X4(4)、3-23X10(10))及其CK(3-237(7)、3-238(8))再進(jìn)行一次檢測(cè)。變異株系和CK各選2株,分別采取2~8位羽葉的頂部葉片各2片放入密封透明塑料袋中,按照隨機(jī)區(qū)組排列懸掛于展示柜同層網(wǎng)格上,然后按照表1的時(shí)間、溫度進(jìn)行處理,根據(jù)葉片的存活狀況鑒定材料的抗寒能力。2結(jié)果與分析2.1滲透2.1.1滲透率的比較(1)不同處理組間滲透率比較:從表2可以看出,普安紫洋芋的滲透率在常溫下為45.9%,4℃時(shí)為40.5%,0℃時(shí)為44.3%,3個(gè)處理組滲透率的比較結(jié)果是常溫>0℃>4℃。(2)不同單株間滲透率比較:在常溫CK組、4℃組和0℃組中,滲透率在40%以下的單株分別有1、4和2株,4℃組的低滲透率單株數(shù)最多(表2)。3個(gè)處理組中,最低滲透率分別為30.0%(CK組1號(hào)單株)、30.7%(4℃組9號(hào)單株)、29.9%(0℃組13號(hào)單株),表明這3株在同組處理中相比較而言抗寒能力較強(qiáng),單株間的抗寒能力表現(xiàn)差異。2.1.2溫度對(duì)誤加物滲透系的影響由表3看出,常溫下費(fèi)烏瑞它2個(gè)變異株系的平均滲透率為93.9%,在4℃溫度下為16.9%,-3℃溫度下為75.5%。不同溫度處理組之間滲透率的結(jié)果與普安紫洋芋一致,均是常溫>0℃>4℃。從Ⅲ-25-5及CK滲透率結(jié)果看出,變異株系與CK相差不大;從3-23X及CK的滲透率結(jié)果看出,3-23CK的滲透率明顯低于3-23X,表明其抗寒能力強(qiáng)于相應(yīng)的變異株系。2.2低溫應(yīng)激反應(yīng)從表4結(jié)果看,2個(gè)變異株系常溫對(duì)照組的吸光值為0.114~0.155,在-3℃處理組吸光值為0.029~0.035,低于常溫組,說明SOD酶在-3℃的低溫下活性增強(qiáng),是植株對(duì)低溫應(yīng)激反應(yīng)的表現(xiàn)。在常溫和-3℃處理下,III-25-5及CK的吸光值均相差較小,該株系在2010年冬經(jīng)過近2周數(shù)次0、-2℃的低溫馴化,表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗寒能力。而在室內(nèi)鑒定條件下,可能低溫馴化時(shí)間不夠,Ⅲ-25-5低溫應(yīng)激反應(yīng)體系未能發(fā)揮作用。在3-23X及CK處理組中,常溫和-3℃結(jié)果均為CK大于其變異株系,表明對(duì)照組抗寒能力較高。這個(gè)結(jié)果與滲透率的檢測(cè)結(jié)果一致,表明2種檢測(cè)方法均能反應(yīng)植株的抗寒能力。2.3低溫泄漏2.3.1溫脅迫鑒定結(jié)果費(fèi)烏瑞它2個(gè)變異株系及其對(duì)照(與滲透率和SOD檢測(cè)為同一株系不同單株)離體葉片低溫脅迫鑒定結(jié)果表明,當(dāng)最低處理溫度為-6℃時(shí),Ⅲ-25-5的存活率85.7%,其對(duì)照的存活率為57.1%;而3-23X及對(duì)照(3-23CK)的存活率為100%(表5,圖1)。說明3-23X及CK對(duì)低溫的應(yīng)激反應(yīng)速度比Ⅲ-25-5及CK延緩。2.3.2葉片抗逆性測(cè)定當(dāng)最低處理溫度為-7℃時(shí),費(fèi)烏瑞它輻射變異株系3-23X的離體葉片的存活率為42.9%,其CK的存活率為7.1%(表6),表明3-23X的抗寒能力比CK強(qiáng)。該結(jié)果與同一株系不同單株滲透率和SOD的檢測(cè)結(jié)果有差異,原因可能是不同單株間抗寒能力差異所致。3調(diào)整溫度和滲流率本研究結(jié)果表明,普安紫洋芋和費(fèi)烏瑞它變異株系的滲透率均是常溫>0℃>4℃。一般在常溫下,細(xì)胞的抗逆體系和機(jī)制未能表達(dá),表現(xiàn)為滲透率較高;當(dāng)溫度下降到4℃時(shí),細(xì)胞內(nèi)的抗寒體系發(fā)生應(yīng)激反應(yīng),產(chǎn)生一系列的代謝產(chǎn)物來抵御低溫對(duì)細(xì)胞的傷害,使得其滲透率降低;而當(dāng)溫度持續(xù)下降到0℃后,細(xì)胞膜開始受到破壞,細(xì)胞內(nèi)的電解質(zhì)滲透到細(xì)胞膜之外,使得電解質(zhì)滲透率增加,而由于此時(shí)抗寒體系仍有一定的作用,故此時(shí)的滲透率大于4℃而又小于常溫下的滲透率,總體呈現(xiàn)一個(gè)倒拋物線的趨勢(shì)。丁燦以甘蔗為材料研究了不同溫度下的電解質(zhì)滲透率,設(shè)置的溫度為0、-3、-6℃,結(jié)果滲透率隨溫度的下降呈現(xiàn)上升的趨勢(shì),與本試驗(yàn)的4、0℃(或-3℃)滲透率的變化趨勢(shì)一致。祁云等的研究結(jié)果表明,白菜的SOD酶活性隨溫度的降低而升高,這與本試驗(yàn)結(jié)果基本一致,其結(jié)果還表明在達(dá)到臨界溫度之后酶活性下降,而本試驗(yàn)的SOD酶活性