乳腺癌多藥耐藥細胞株mcf-7a02對sorcin表達的影響

乳腺癌多藥耐藥細胞株mcf-7a02對sorcin表達的影響

乳腺癌細胞的多藥物耐藥性（mdr）是乳腺癌化療失敗的主要原因之一?？扇苄阅退幭嚓P(guān)鈣結(jié)合蛋白基因(Sorcin)是近年來發(fā)現(xiàn)的耐藥相關(guān)基因,體外研究發(fā)現(xiàn)其在多種腫瘤耐藥細胞系中表達增高,如乳腺癌MCF-7/A02細胞,但其介導耐藥的機制尚不清楚。2009年10月～2011年2月,我們使用針對Sorcin特異的siRNA,通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法,觀察抑制Sorcin基因表達能否有效逆轉(zhuǎn)MCF-7/A02細胞對化療藥物的敏感性,并初步探討其機制。1材料和方法1.1測定項目及試劑人乳腺癌多藥耐藥細胞株MCF-7/A02,常規(guī)培養(yǎng)傳代;TrizolRNA提取試劑盒,M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,脂質(zhì)體LipofectamineTM2000,RPMI1640,IMDM,低血清培養(yǎng)基OPTI-MEM,AnnexinⅤ-FITC/PI雙染凋亡檢測試劑盒,阿霉素(ADR)、依托泊苷(VP-16)、高三尖杉酯堿(HHT)、長春新堿(VCR),MTT,堿性蕊香紅-123(Rho-123),RNA干擾試劑盒,Bcl-2、Bax抗體,BCA蛋白定量試劑盒。1.2方法1.2.1脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染與sorcin基因檢測5/ml,每孔400μl接種24孔板;觀察組采用脂質(zhì)體Lipofectamine2000試劑盒轉(zhuǎn)染針對Sorcin基因的siRNA,對照組不轉(zhuǎn)染。1.2.2adr、vp-16、hct、vcr的測定取兩組MCF-7/A02細胞,用含10%血清的RMPI1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為1.1×104/ml,每孔180μl接種96孔板。48h后分別加入不同濃度的ADR、VP-16、HHT、VCR,每個濃度設3個平行孔,每孔終體積為200μl;培養(yǎng)48h后,每孔加入5mg/ml的MTT20μl,37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h,2000r/min離心10min,棄上清,每孔加入100μlDMSO,振蕩至沉淀完全溶解,在酶標儀上檢測波長為546nm的光密度(OD)值,計算各組藥物的半數(shù)抑制濃度(IC50)。1.2.3細胞活力試驗收集轉(zhuǎn)染48h的觀察組及對照組細胞,PBS洗2遍;用無血清的RMPI1640調(diào)整細胞密度為1×106/ml,加入終濃度200nM的Rho-123,37℃震蕩水浴孵育1.5h;收集細胞,預冷PBS洗2遍;加入適量的冷PBS,以流式細胞儀檢測細胞內(nèi)Rho-123的熒光強度,以此觀察細胞對化療藥物的外排功能。1.2.4vp-16共育取兩組細胞制成1×105/ml的細胞懸液,接種24孔板,與20μg/ml的VP-16共育;24h后收集細胞,PBS洗2次。采用AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法檢測凋亡及壞死細胞,按試劑盒說明書操作,于1h內(nèi)用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。1.2.5蛋白凝膠電泳采用Westernblot法。收集轉(zhuǎn)染72h的觀察組及對照組細胞,加入預冷的含PMSF的RIPA裂解液,超聲細胞破碎儀破碎細胞;4℃12000r/min離心15min,上清轉(zhuǎn)入新的EP管中。采用BCA試劑盒進行蛋白定量。各取50μg總蛋白進行SDS凝膠電泳,電泳后轉(zhuǎn)移至硝化纖維素膜,4℃封閉過夜;PBST洗3遍后,分別與合適稀釋度的一抗室溫作用2h,羊抗兔/兔抗羊HRP-IgG作用1h,用ECL方法顯色。以目標條帶與內(nèi)參條帶的凈光密度比值表示目標蛋白表達量。1.2.6統(tǒng)計方法采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。結(jié)果以xˉ±sxˉ±s表示,組間比較采用雙尾Student′st檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2結(jié)果2.1兩組p的比較觀察組ADR、VP-16、HHT、VCR的IC50分別為(19.92±1.29)、(31.47±2.36)、(4.19±0.27)、(2.96±0.23)μg/ml,對照組分別為(111.57±5.6)、(144.77±20.43)、(24.30±0.43)、(5.89±0.28)μg/ml,兩組比較,P均<0.01。2.2抑制氨基表達對vp-16的誘導。mcf-7A02細胞凋亡的影響觀察組的細胞凋亡率為9.15%±0.15%,對照組為4.10%±0.12%,兩組比較,P<0.01。2.3抑制sic-7對細胞外排功能的影響觀察組細胞內(nèi)Rho-123的熒光強度為6.34±0.86,對照組為5.42±0.73,兩組比較,P>0.05。2.4bax蛋白表達量觀察組細胞中Bcl-2為0.59±0.032、Bax蛋白表達量為1.80±0.03,對照組分別為0.69±0.025和1.94±0.04,兩組比較,P均<0.05。3抑制耐藥機制Sorcin又稱為VP19、CP22,是一種相對分子質(zhì)量22kDa的胞質(zhì)蛋白,具有典型“E-Fhand”結(jié)構(gòu)的鈣結(jié)合位點,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)其在多種MDR腫瘤細胞中高表達。為闡明Sorcin參與乳腺癌耐藥的機制,我們首先利用特異性沉默Sorcin基因表達的siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)降低MCF-7/A02細胞中Sorcin的表達量,觀察了抑制Sorcin表達后MCF-7/A02細胞對化療藥的敏感性變化。結(jié)果表明,Sorcin-siRNA轉(zhuǎn)染的細胞對ADR、VP-16、VCR、HHT的敏感性顯著增強,提示Sorcin基因確實在MCF-7/A02細胞MDR機制中起到了一定作用。目前,研究認為腫瘤耐藥主要有三種機制,其中腫瘤細胞藥物外排功能和細胞本身發(fā)生變化(如DNA損傷修復增強、凋亡抗性改變等)為最主要因素。①藥物外排功能:這涉及了ATP結(jié)合子型膜載體蛋白家族,也是最常見的耐藥機制,其中多藥耐藥糖蛋白(P-gp)介導的MDR研究最為廣泛和深入。為闡明Sorcin耐藥機制是否與細胞藥物外排功能有關(guān),我們抑制Sorcin表達后觀察MCF-7/A02細胞對Rho-123的外排功能改變。結(jié)果表明,抑制Sorcin高表達并不能降低細胞外排功能,由此推斷Sorcin并非通過增加藥物外排功能產(chǎn)生耐藥。②凋亡受阻:許多抗腫瘤藥物都是通過使腫瘤細胞發(fā)生凋亡而不是壞死發(fā)生作用的。凋亡需要許多基因的相互作用和(或)共同作用。參與凋亡過程調(diào)控的基因表達失控,例如激活細胞凋亡基因的丟失或抑制細胞凋亡基因的過度表達,都可能導致腫瘤細胞對廣譜抗腫瘤藥物的細胞毒作用產(chǎn)生抗藥性。在耐藥方面對Bcl-2家族、p53和Fas的研究較多,如促凋亡基因Bax的缺失或抗凋亡基因Bcl-2的過度表達等均可引起腫瘤細胞的耐藥。本研究結(jié)果表明,抑制Sorcin表達后部分逆轉(zhuǎn)了乳腺癌耐藥細胞MCF-7/A02細胞對化療藥物凋亡刺激的耐