親和層析原理和步驟課件

親和層析

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親和層析原理和步驟一、原理親和層析是利用生物大分子所具有的專一親和力而設計的純化技術尋找配基配基固定化制成親和層析柱親和層析原理和步驟基本過程+固相化親和層析原理和步驟++洗脫吸附親和層析原理和步驟解吸+親和層析原理和步驟載體親和層析原理和步驟樣品固相化

再生親和層析原理和步驟親和層析原理和步驟親和層析原理和步驟酶：基質(zhì)類似物，抑制劑，輔酶抗體：抗原，病毒，細胞細胞：細胞表面特異蛋白，外源凝集素核酸：互補堿基序列，組蛋白，核酸聚合酶激素或藥物：受體，載體蛋白外源凝集素：多糖，糖蛋白，細胞表面受體，細胞常見具有專一性親和力的生物分子對：親和層析原理和步驟親和層析原理和步驟親和層析原理和步驟（一）載體的選擇1、載體要求：（1）不溶性（2）滲透性：疏松網(wǎng)狀結構，有良好的液體流動性（3）化學和機械性能穩(wěn)定（4）具備大量能被活化的基因（5）抗微生物和酶的侵蝕親和層析原理和步驟2、常用載體（1）纖維素特點：價廉、來源充足纖維性、非均一性限制大分子的摻入非專一性吸附嚴重用于抗體和酶的純化（2）葡聚糖凝膠特點：化學及物理性質(zhì)穩(wěn)定多孔性比瓊脂糖低親和層析原理和步驟（3）瓊脂糖凝膠濃度商品2%

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凝膠濃度越低結構越疏松機械強度越低親和層析原理和步驟（4）聚丙烯酰胺凝膠（5）多孔玻璃特點：不受微生物的侵蝕耐酸、堿、有機溶劑表面非專一性吸附特點：物理化學性質(zhì)穩(wěn)定抗微生物侵蝕能力比瓊脂糖強可供化學反應的酰胺基較多親和層析原理和步驟（二）配基的選擇1、對于欲純化的物質(zhì)應有專一親和力2、必須具備能被修飾的功能基團親和層析原理和步驟以酶和底物為例：E+LELKL=[E][L]/[EL]=[E0-EL][L0-EL]/[EL]E0、L0：起始濃度當L0》E0時KL=[E0-EL][L0]/[EL][EL]=[E0-EL][L0]/KLKd=結合酶/游離酶=[EL]/[E0-EL]=[L0]/KLKLKL：解離常數(shù)E：酶L：底物EL：復合物親和層析原理和步驟（三）固相化——將配體以共價鍵連接于固相基

質(zhì)上制成固相化吸附劑載體的排斥效應載體的空間障礙親和層析原理和步驟二、親和層析分離1、裝柱和平衡2、上樣、親和吸附3、洗脫無效洗脫吸附效率不高有效吸附親和層析原理和步驟洗脫方法（1）非特異性洗脫：改變洗脫液pH值離子強度梯度洗脫（2）特殊洗脫：當?shù)鞍孜骄o密或上述方法洗脫會引起失活，可用專一的化學方法裂解配基與載體的連接鍵，再用透析或凝膠層析法去除配基。斷鍵方法：硫酯鍵、偶氮鍵、二硫鍵（3）專一性洗脫親和層析原理和步驟

已使用過和柱，經(jīng)過再生處理，去除非特異吸附的雜質(zhì)后，可重復使用再生步驟：起始緩沖液重復平衡一次用高離子強度和低離子強度溶液處理用弱酸或弱堿溶液處理4、親和柱的再生：親和層析原理和步驟三、特點

1、一步純化步驟2、產(chǎn)物非常純3、可從很稀的溶液中純化到所需物質(zhì)4、可去除已變性或部分降解物質(zhì)親和層析原理和步驟四、應用1、分離和純化2、分辨化學或遺傳學上修飾的酶3、純化親和標記的活化中心肽段和蛋白質(zhì)

結構研究4、純化人工合成的多肽和蛋白質(zhì)5、解釋酶作用機理親和層析原理和步驟親和層析原理和步驟載體親和層析原