核酸的生物合成完整版

核酸的生物合成基因(gene)：

為蛋白質(zhì)或RNA編碼的DNA功能片段，是以堿基排列順序的方式儲(chǔ)存的遺傳信息?；蚪M（genome)：

某一物種擁有的全部遺傳物質(zhì)，從分子意義上說，是指全部DNA序列。

轉(zhuǎn)錄翻譯復(fù)制DNARNA蛋白質(zhì)

逆轉(zhuǎn)錄*中心法則(thecentraldogma)

轉(zhuǎn)錄翻譯復(fù)制DNARNA蛋白質(zhì)

逆轉(zhuǎn)錄

轉(zhuǎn)錄翻譯復(fù)制DNARNA蛋白質(zhì)

逆轉(zhuǎn)錄

轉(zhuǎn)錄翻譯復(fù)制DNARNA蛋白質(zhì)

逆轉(zhuǎn)錄

轉(zhuǎn)錄翻譯復(fù)制DNARNA蛋白質(zhì)

逆轉(zhuǎn)錄

轉(zhuǎn)錄翻譯復(fù)制DNARNA蛋白質(zhì)

逆轉(zhuǎn)錄主要內(nèi)容●

DNA的生物合成——復(fù)制

●

RNA的生物合成——轉(zhuǎn)錄

●

蛋白質(zhì)的生物合成——翻譯

●

基因重組與基因工程第一節(jié)

DNA的生物合成

DNABiosynthesis一、DNA的復(fù)制二、逆轉(zhuǎn)錄三、DNA的損傷和修復(fù)四、多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）一、DNA的復(fù)制DNA分子是如何通過復(fù)制把遺傳信息高度保真性地（fidelity）傳遞給子代細(xì)胞的？一、DNA的復(fù)制概念：DNA在復(fù)制時(shí)，以親代DNA的每一股作模板，合成完全相同的兩個(gè)雙鏈子代DNA，每個(gè)子代DNA中都含有一股親代DNA鏈，這種現(xiàn)象稱為DNA的半保留復(fù)制(semi-conservativereplication)。（一）復(fù)制的基本規(guī)律1、半保留復(fù)制復(fù)制親代DNA子代DNADNA半保留復(fù)制示意圖Watson和Crick于1953年假定DNA的復(fù)制為半保留復(fù)制。

全保留式半保留式混合式DNA復(fù)制的三種可能方式1958年M.Meselson

和F.M.Stall利用同位素15N標(biāo)記大腸桿菌，首先證明了DNA半保留復(fù)制。15N-15N14N-14N15N-14N半保留復(fù)制的生物學(xué)意義按半保留復(fù)制方式，子代DNA與親代DNA的堿基序列一致，即子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的保守性。遺傳的保守性，是物種穩(wěn)定性的分子基礎(chǔ)，但不是絕對(duì)的。DNA在復(fù)制時(shí)，需在特定的位點(diǎn)起始，這是一些具有特定核苷酸排列順序的片段，即復(fù)制起始點(diǎn)(origin)

。在原核生物中，復(fù)制起始點(diǎn)通常為一個(gè)，而在真核生物中則為多個(gè)。2.有一定的復(fù)制起始點(diǎn)放射自顯影證實(shí)親代鏈解開后立即進(jìn)行復(fù)制，沒有發(fā)現(xiàn)單鏈DNA。細(xì)菌和酵母菌中DNA復(fù)制起始點(diǎn)的堿基序列習(xí)慣上把兩個(gè)相鄰DNA復(fù)制起始點(diǎn)之間的距離（或DNA片段）定為一個(gè)復(fù)制子(replicon)。復(fù)制子是獨(dú)立完成復(fù)制的功能單位。DNA復(fù)制時(shí)，局部雙螺旋解開形成兩條單鏈，這種叉狀結(jié)構(gòu)稱為復(fù)制叉。起點(diǎn)起點(diǎn)起點(diǎn)起點(diǎn)起點(diǎn)起點(diǎn)3、復(fù)制方式E.coil基因結(jié)構(gòu)與復(fù)制起點(diǎn)oriterABCA.環(huán)狀雙鏈DNA及復(fù)制起始點(diǎn)B.復(fù)制中的兩個(gè)復(fù)制叉C.復(fù)制接近終止點(diǎn)(termination,ter)DNA的雙向復(fù)制示意圖DNA聚合酶只能以5'→3'方向聚合子代DNA鏈，即模板DNA鏈的方向必須是3'→5'。由于DNA分子中兩條鏈的走向相反，因此當(dāng)分別以兩條親代DNA鏈作為模板聚合子代DNA鏈時(shí)，子代鏈的聚合方向也是不同的。4、半不連續(xù)復(fù)制3

5

3

5

3′5′3′5′解鏈方向領(lǐng)頭鏈(leadingstrand)隨從鏈(laggingstrand)DNA的半不連續(xù)復(fù)制3′5′半不連續(xù)復(fù)制動(dòng)畫岡崎片段：

?1968年日本生化學(xué)者岡崎用電鏡及放射自顯影技術(shù)，觀察到DNA復(fù)制中出現(xiàn)一些不連續(xù)的片段，將這些不連續(xù)的片段稱為岡崎片段。

?原核生物:1000~2000個(gè)核苷酸

?真核生物:100~200個(gè)核苷酸以3’→5’方向的親代DNA鏈作模板的子代鏈在復(fù)制時(shí)基本上是連續(xù)進(jìn)行的，其子代鏈的聚合方向?yàn)?’→3’，這一條鏈被稱為領(lǐng)頭鏈(leadingstrand)。以5’→3’方向的親代DNA鏈為模板的子代鏈在復(fù)制時(shí)則是不連續(xù)的，其鏈的聚合方向也是5’→3’，這條鏈被稱為隨從鏈(laggingstrand)。領(lǐng)頭鏈連續(xù)復(fù)制而隨從鏈不連續(xù)復(fù)制，就是復(fù)制的半不連續(xù)性。

（二）DNA復(fù)制的體系

底物:dNTP(dATP、dGTP

、dCTP

、dTTP)

聚合酶:

依賴DNA的DNA聚合酶(DNA-pol)

模板:解開成單鏈的DNA母鏈

引物:提供3'-OH末端的寡核苷酸

其他酶和蛋白質(zhì)因子:拓?fù)洚悩?gòu)酶、解螺旋酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白、引物酶、連接酶復(fù)制的化學(xué)反應(yīng)

(dNMP)n

+

dNTP→(dNMP)n+1

+

PPi

聚合反應(yīng)的特點(diǎn)以DNA單鏈為模板以dDNA為原料引物提供3′－OH聚合方向?yàn)?′→3′3′1、拓?fù)洚悩?gòu)E（動(dòng)畫）10

8

局部解鏈后DNA復(fù)制過程中正超螺旋的形成解鏈過程中正超螺旋的形成解鏈過程中，DNA分子會(huì)過度擰緊、打結(jié)、纏繞、連環(huán)等現(xiàn)象。拓?fù)洚悩?gòu)酶的作用特點(diǎn)既能水解、又能連接磷酸二酯鍵

拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ

拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ分類拓?fù)洚悩?gòu)E不需要能量或輔助因子如：ATP和NAD＋需要能量或輔助因子如：ATP和NAD＋拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ的作用拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ的作用通過催化DNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的變化，減少由于解鏈形成的張力解鏈雙螺旋存在張力DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ張力解除雙螺旋變成松弛狀態(tài)解螺旋酶(helicase)又稱解鏈酶或rep蛋白利用ATP供能，作用于氫鍵，使DNA雙鏈解開成為兩條單鏈。每解開一對(duì)堿基，需消耗2分子ATP。2.解旋酶3、單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB)3′5′5′5′3′SSB的作用①保護(hù)單鏈DNA免遭核酸的降解。防止單鏈再次形成雙鏈③降低DNA的Tm，促進(jìn)DNA解鏈。SSB4、引發(fā)酶和引發(fā)體3'HO5'3

5

3

5

引物酶是一種依賴DNA的RNA聚合酶，該酶以DNA為模板，合成一段RNA引物，為DNA聚合酶提供自由的3′-OH，使子代DNA鏈能夠開始聚合。引物引物酶

DnaADNA拓?fù)洚悩?gòu)酶

DnaBDnaCSSB

DnaA

DnaBDnaCDNA拓?fù)洚悩?gòu)酶引物酶SSB3

5

3

5

含有解螺旋酶(DnaB蛋白)、DnaC蛋白、引物酶和DNA復(fù)制起始區(qū)域的復(fù)合結(jié)構(gòu)稱為引發(fā)體。

引發(fā)體的組裝形成引物酶的作用：為DNA聚合酶提供自由的3′－OHRNA引物的大小，在原核生物中通常為50~100個(gè)核苷酸，而在真核生物中約為10個(gè)核苷酸。RNA引物的堿基順序，與其模板DNA的堿基順序相配對(duì)。5、DNA聚合酶全稱：依賴DNA的DNA聚合酶(DNA-dependentDNApolymerase,DDDP)簡(jiǎn)稱：DNA-pol活性：1.5

3

的聚合酶活性

2.核酸外切酶活性大腸桿菌中至少有5種，分別命為DNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ。①DNA聚合酶I（單體酶：?jiǎn)坞逆湥┲饕δ埽贺?fù)責(zé)DNA的損傷修復(fù)及在DNA復(fù)制中切除引物，填補(bǔ)空隙的作用。若用枯草桿菌蛋白酶處理此酶，可得兩個(gè)片段。蛋白酶切口Klenow片段的分子結(jié)構(gòu)大片段保留了兩種酶活性,即5'→3'聚合酶和3'→5'外切酶活性，通常被稱為Klenowfragment。5

→3

聚合酶活性5′AGCTTCAGGATA

3′

|||||||||||3′TCGAAGTCCTAGCGAC5′

3

5

外切酶活性

5

3

外切酶活性?能切除突變的DNA片段。能辨認(rèn)錯(cuò)配的堿基對(duì)，并將其水解。

DNA聚合酶的核酸外切酶活性3’→5’外切酶活力DNA聚合酶I小結(jié)②DNA聚合酶Ⅱ（單體酶）

主要功能參于DNA的損傷修復(fù)，具有5′→3′聚合活力，較弱，3′→5′外切活性。但無5′→3′外切活性。③DNA聚合酶Ⅲ（寡聚酶）

是催化大腸桿菌DNA復(fù)制的主酶，全酶有10種亞基，含Zn2+。大腸桿菌DNA聚合酶Ⅲ全酶的結(jié)構(gòu)和功能

延長(zhǎng)因子DNA聚合酶Ⅲ兩個(gè)亞基夾住DNADNA聚合酶Ⅲ異二聚體核心酶校對(duì)引物的結(jié)合和識(shí)別促使核心酶二聚化原核生物DNA聚合酶－真核DNA聚合酶聚合酶DNA連接酶(DNAligase)可催化兩段DNA片段之間磷酸二酯鍵的形成，從而把兩段相鄰的DNA鏈連接成一條完整的鏈。6、DNA連接酶功能連接復(fù)制過程形成的DNA片段,形成一個(gè)3′,5′-磷酸二酯鍵連接酶ATGCCGPPOHAPTATGCCGPAPTP連接酶DNA連接酶ATP（NAD+）ADP+Pi（NMN++AMP）HO5’3’5’3’3’5’5’3’DNA連接酶的連接作用連接酶連接切口Mg2+連接酶ATP或NAD＋AMP+PPi或NMN+AMPATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPPOHTGGATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPTGGP缺口3'3'5'5'5'5'3'3'模板鏈模板鏈DNA連接酶催化的條件是：①

需一段DNA片段具有3'-OH，而另一段DNA片段具有5'-Pi基；②

未封閉的缺口位于雙鏈DNA中，即其中有一條鏈?zhǔn)峭暾模虎?/p>

需要消耗能量，在原核生物中由NAD+供能，在真核生物中由ATP供能。DNA連接酶在復(fù)制中起最后接合缺口的作用。在DNA修復(fù)、重組及剪接中也起縫合缺口作用。是基因工程的重要工具酶之一。DNA連接酶的作用DNA復(fù)制酶系總覽（三）原核生物DNA復(fù)制DNA+n1dATPn2dGTPn3dCTPn4dTTPDNA+(n1+n2+n3+n4)PPiＤＮＡ聚合酶Mg2+以四種dNTP

為底物在DNA模板指令下，按堿基配對(duì)的原則，由DNA聚合酶催化，向DNA的3′－OH端添加核苷酸，以5′→3′的方向合成與模板互補(bǔ)的新鏈。1、復(fù)制的起始原核生物：特定位點(diǎn)開始，特定位點(diǎn)終止，只有一個(gè)復(fù)制子。（基因組能獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制的單位）。真核生物：多個(gè)位點(diǎn)起始，多復(fù)制子。大腸桿菌復(fù)制起始點(diǎn)：oriC（original）

終止點(diǎn)：ter（terminate）一些特殊的Pr可以識(shí)別并結(jié)合到復(fù)制起點(diǎn)，隨即使DNA雙螺旋局部解鏈，形成復(fù)制眼，在其兩端的DNA的兩股鏈呈丫字狀，稱為復(fù)制叉。分別向兩側(cè)進(jìn)行復(fù)制，通常復(fù)制叉雙向等速前進(jìn)，迅速生長(zhǎng)的細(xì)菌，第一輪復(fù)制未完成就啟動(dòng)第二次復(fù)制。DNA復(fù)制的起始階段，由下列兩步構(gòu)成。

1．解旋解鏈，形成復(fù)制叉：由拓?fù)洚悩?gòu)酶和解鏈酶作用，使DNA的超螺旋及雙螺旋結(jié)構(gòu)解開，堿基間氫鍵斷裂，形成兩條單鏈DNA。單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB）四聚體結(jié)合在兩條單鏈DNA上，形成復(fù)制叉。2．引發(fā)體組裝和引物合成：由解螺旋酶(DnaB蛋白)、DnaC蛋白、引物酶(DnaG蛋白)和DNA復(fù)制起始區(qū)域形成引發(fā)體；在引物酶的催化下，以DNA為模板，合成一段短的RNA片段，從而獲得3'端自由羥基（3'-OH）。

5'

3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-polDNA復(fù)制的延長(zhǎng)過程2、DNA鏈的合成與延伸領(lǐng)頭鏈的合成過程隨從鏈的合成過程DNA聚合酶ⅢRNA引物領(lǐng)頭鏈的合成是連續(xù)的，而隨從鏈的合成是不連續(xù)的，為什么？復(fù)制過程簡(jiǎn)圖解螺旋酶3′5′5′3′3′5′DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶ⅡDNA聚合酶Ⅲ引發(fā)體連接酶DNA復(fù)制系統(tǒng)SSPDNA聚合酶I原核生物基因是環(huán)狀DNA，雙向復(fù)制的復(fù)制片段在復(fù)制的終止點(diǎn)(ter)處匯合。

E.colioriter8232

ori

terSV405003、復(fù)制的終止

在復(fù)制過程中形成的RNA引物，需由RNA酶來水解去除；RNA引物水解后遺留的缺口，由DNA聚合酶Ⅰ（原核生物）或DNA聚合酶

（真核生物）催化延長(zhǎng)缺口處的DNA，直到剩下最后一個(gè)磷酸酯鍵的缺口。（1）去除引物，填補(bǔ)缺口：在DNA連接酶的催化下，生成最后一個(gè)磷酸酯鍵，將岡崎片段連接起來，形成完整的DNA長(zhǎng)鏈。（2）連接岡崎片段5

5

5

RNA酶OHP5

DNA-polⅠdNTP5

5

PATP

ADP+Pi5

5

DNA連接酶

隨從鏈上不連續(xù)性片段的連接拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ?qū)蓚€(gè)子代DNA環(huán)分離為了保證遺傳的穩(wěn)定，DNA的復(fù)制必須具有高保真性。DNA復(fù)制時(shí)的保真性主要與下列因素有關(guān)：

1．遵守嚴(yán)格的堿基配對(duì)規(guī)律；

2．DNA聚合酶在復(fù)制時(shí)對(duì)堿基的正確選擇；

3．對(duì)復(fù)制過程中出現(xiàn)的錯(cuò)誤及時(shí)進(jìn)行校正。DNA復(fù)制的保真性(fidelity)：DNA-pol的核酸外切酶活性和及時(shí)校讀A：DNA-pol的外切酶活性切除錯(cuò)配堿基；并用其聚合酶活性摻入正確配對(duì)的底物。B：堿基配對(duì)正確，DNA-pol不表現(xiàn)外切酶活性。（四）真核生物DNA復(fù)制真核細(xì)胞染色體DNA分子為線性的。比原核細(xì)胞DNA分子大，復(fù)制更為復(fù)雜。為多復(fù)制子復(fù)制（多起點(diǎn)雙向復(fù)制），在全部染色體復(fù)制完成前，各復(fù)制子不能再開始新一輪復(fù)制。真核生物DNA復(fù)制起始復(fù)合物的組裝和激活分屬于不同的細(xì)胞周期。端粒（telomere）是指真核生物染色體線性DNA分子末端的結(jié)構(gòu)部分，通常膨大成粒狀。真核生物端粒的形成：在DNA復(fù)制的同時(shí)另外還要組裝成核小體。功能?維持染色體的穩(wěn)定性?保證DNA復(fù)制的完整性端粒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)?由末端單鏈DNA序列和蛋白質(zhì)構(gòu)成。?末端DNA序列是多次重復(fù)的富含G、T堿基的短序列。TTTTGGGGTTTTGGGG…線性DNA在復(fù)制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出現(xiàn)縮短。故需要在端粒酶（telomerase）的催化下，進(jìn)行延長(zhǎng)反應(yīng)。5

3

3

55

3

3

5端粒酶(telomerase)端粒酶是一種RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體，它可以其RNA為模板，通過逆轉(zhuǎn)錄過程對(duì)末端DNA鏈進(jìn)行延長(zhǎng)。端粒酶的分子結(jié)構(gòu)端粒酶RNA(humantelomeraseRNA,hTR)端粒酶協(xié)同蛋白(humantelomeraseassociatedprotein1,hTP1)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTRT)

端粒酶的組成端粒酶的爬行模型（動(dòng)畫演示）端粒酶(telomerase)的作用機(jī)制——爬行模型二、逆轉(zhuǎn)錄

以RNA為模板，由RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶（逆轉(zhuǎn)錄E）催化，合成DNA的過程。逆轉(zhuǎn)錄病毒和逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄病毒細(xì)胞內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象：RNA模板逆轉(zhuǎn)錄酶DNA-RNA雜化雙鏈RNA酶單鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄酶雙鏈DNA1、逆轉(zhuǎn)錄酶的性質(zhì)①寡聚E②兼具有三種酶的活力:

RNA指導(dǎo)的DNA聚合E活力DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活力

RNaseH（核糖核酸酶H）活力

RNaseH：5′→3′和3′→5′外切酶活力，可除去DNA、RNA雜交分子中的RNA。2、逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄過程RNA（+）→RNA（+）/cDNA（-）→DNA（+）/cDNA（-）→RNA（+）3、逆轉(zhuǎn)錄的生物學(xué)意義逆轉(zhuǎn)錄過程的發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)充了中心法則。它有助于人們對(duì)RNA病毒致癌機(jī)制的了解，并對(duì)防治腫瘤提供了重要線索。逆轉(zhuǎn)錄酶已成為分子生物學(xué)和基因工程中常用的一種工具酶，利用它可以從mRNA合成相應(yīng)的cDNA，在基因結(jié)構(gòu)研究、氨基酸序列預(yù)測(cè)以及基因工程中具有十分重要的意義。三、DNA的損傷和修復(fù)1、DNA的損傷X－射線、紫外線照射DNA，引起損傷。如形成胸腺嘧啶二聚體。嘧啶二聚體的形成

UV（二）DNA損傷的修復(fù)DNA損傷修復(fù)(repair)：是對(duì)已發(fā)生分子改變的補(bǔ)償措施，使其盡可能回復(fù)為原有的天然狀態(tài)。光修復(fù)(lightrepair)切除修復(fù)(excisionrepair)重組修復(fù)(recombinationrepair)SOS修復(fù)

修復(fù)的主要類型：無差錯(cuò)修復(fù)有差錯(cuò)傾向修復(fù)1、直接修復(fù)（光修復(fù)）可見光（400－500nm）激活光裂合酶，將嘧啶二聚體分開，恢復(fù)成單獨(dú)的嘧啶堿基，對(duì)單細(xì)胞生物比較重要，高等哺乳動(dòng)物無光裂合酶。修復(fù)過程由光裂合酶(photolyase)催化完成。光裂合酶的分子結(jié)構(gòu)光直接修復(fù)這也是一種廣泛存在的修復(fù)機(jī)制，可適用于多種DNA損傷的修復(fù)。切除修復(fù)機(jī)制的基本過程是將受損的DNA片段切除，然后再以對(duì)側(cè)鏈為模板，重新合成新鏈進(jìn)行修復(fù)。2、切除修復(fù)（復(fù)制前修復(fù)）（1）切斷：專一性的內(nèi)切酶在靠近二聚體處切斷單鏈DNA。（2）修復(fù)合成：DNA聚合酶在斷口處進(jìn)行局部修復(fù)合成。（3）切除：5′—核酸外切酶切去嘧啶二聚體片段。（4）連接：連接酶將新合成的DNA鏈與原來的DNA鏈連在一起。切除修復(fù)3、重組修復(fù)（動(dòng)畫）當(dāng)DNA損傷廣泛難以繼續(xù)復(fù)制時(shí)，由此而誘發(fā)出一系列復(fù)雜的反應(yīng)。在E.coli中，各種與修復(fù)有關(guān)的基因，組成一個(gè)稱為調(diào)節(jié)子(regulon)的網(wǎng)絡(luò)式調(diào)控系統(tǒng)。這種修復(fù)特異性低，對(duì)堿基的識(shí)別、選擇能力差。通過SOS修復(fù)，復(fù)制如能繼續(xù)，細(xì)胞是可存活的。然而DNA保留的錯(cuò)誤較多，導(dǎo)致較廣泛、長(zhǎng)期的突變。

4、SOS