小鼠前列腺癌原位移植瘤模型的建立及生物學(xué)特性觀察

小鼠前列腺癌原位移植瘤模型的建立及生物學(xué)特性觀察

前列腺是歐洲和美國(guó)最常見的男性腫瘤，在美國(guó)，發(fā)病率最高，死亡率最高。隨著人民生活水平的提高和人群普查的開展,我國(guó)前列腺癌的發(fā)病率近年來有逐漸增高的趨勢(shì)。由于前列腺癌發(fā)病比較隱蔽,在初診時(shí),大約30%～50%的患者有轉(zhuǎn)移發(fā)生,常常喪失了手術(shù)治療的最佳時(shí)機(jī)。因此,研究在體條件下前列腺癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移情況,對(duì)前列腺癌的診斷和治療具有重要意義。我們通過原位移植,建立起C57BL6近交系小鼠前列腺癌原位移植瘤模型,并探討此模型在研究有關(guān)前列腺癌生物學(xué)特性方面的應(yīng)用價(jià)值。材料和方法一、動(dòng)物動(dòng)物大學(xué)C57BL6雄性近交系小鼠36只,購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所。鼠齡8周,體重18～20g,飼養(yǎng)環(huán)境恒溫、恒濕、清潔、無特殊病原體,定期更換墊料,清潔飲用水及飼料供小鼠自由攝入。二、imd培養(yǎng)液的制備小鼠前列腺癌細(xì)胞株RM-1購(gòu)自上海細(xì)胞所。用含10%新生牛血清的IMDM培養(yǎng)液在37℃、5%CO2的孵箱內(nèi)培養(yǎng),以0.25%胰酶消化傳代。三、小鼠低場(chǎng)細(xì)胞rp-1C57BL6近交系小鼠10只,用強(qiáng)力碘消毒小鼠背部,取上述RM-1前列腺癌細(xì)胞溶液接種于小鼠背部皮下,接種細(xì)胞濃度為2×107個(gè)/ml,每只接種100μl。隔日觀察腫瘤生長(zhǎng)情況。四、腫瘤的切除和重建用于外科原位移植(SOI)的腫瘤組織來源于上述鼠背皮下腫瘤模型。狀態(tài)較好的腫瘤組織靠近外周,色白有光澤,質(zhì)韌有彈性,不易破碎。將取出的瘤塊置于低溫、無菌的0.9%生理鹽水中,在10倍顯微鏡下切割成直徑1.5mm大小的腫瘤塊。C57BL6近交系小鼠用戊巴比妥鈉(60mg/kg)麻醉,取仰臥位,強(qiáng)力碘常規(guī)消毒,鋪無菌洞巾。下腹部正中切口長(zhǎng)約1.5～2.0cm,顯露腹腔。將膀胱向上提起,并用無菌棉簽抵住膀胱腹側(cè)壁,暴露腹側(cè)前列腺。鏡下剝離前列腺腹側(cè)筋膜,用尖刀分離兩腹側(cè)葉,將腫瘤塊置于兩腹側(cè)葉間形成的縫隙中,用9-0可吸收線縫合兩腹側(cè)葉及其表面筋膜,使腫瘤塊被嚴(yán)密包埋?；謴?fù)臟器原來的解剖位置,用5-0腸線全層連續(xù)縫合關(guān)腹,待鼠蘇醒后回籠。術(shù)中操作要求輕柔、準(zhǔn)確,避免損傷正常組織和腫瘤組織。五、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)組共有20只小鼠進(jìn)行原位移植。2只移植后4d處死,2只移植后8d處死,其余移植后瀕死時(shí)處死。六、原位移植的病理組織學(xué)觀察小鼠瀕死或處死時(shí)采用過量麻醉方法處死,手術(shù)顯微鏡下觀察原位移植的腫瘤生長(zhǎng)情況和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況,取肝、肺、脾、腎、椎體、淋巴結(jié)和可疑的骨骼進(jìn)行福爾馬林固定,石蠟包埋,切片,HE染色后光鏡下觀察有無轉(zhuǎn)移灶。結(jié)果一、切口感染,睡眠良好C57BL6雄性近交小鼠進(jìn)行RM-1腫瘤塊原位移植術(shù)后,均無意外死亡,無切口感染,進(jìn)食睡眠良好。平均術(shù)后第8天,仔細(xì)觸摸可于下腹部觸及包塊;第15～20天,動(dòng)物出現(xiàn)一般狀態(tài)衰竭,體重下降明顯,可見下腹塑型,可觸及包塊,質(zhì)硬,切開后見腫瘤直徑多在2.0～3.5cm,動(dòng)物原位腫瘤發(fā)生率100%。二、組織學(xué)觀察小鼠進(jìn)行RM-1腫瘤塊原位移植術(shù)后第4天未觸及包塊,組織學(xué)觀察,前列腺、腫瘤共存,以前列腺為主;第8天,可觸及包塊,以腫瘤為主,少許前列腺;第15～20天,包塊質(zhì)硬,活動(dòng)性差,全部為腫瘤占據(jù),前列腺組織見不到。三、腫瘤細(xì)胞移植原位模型組大體見廣泛地浸潤(rùn)周圍盆腔臟器(包括膀胱、精囊等),形成固定的實(shí)質(zhì)性團(tuán)塊?？梢?00%髂動(dòng)脈和主動(dòng)脈旁淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。其中盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生率最高,為16/16;由血行途徑而致的各主要臟器轉(zhuǎn)移灶中,肺的發(fā)生率最高,為8/16。發(fā)生轉(zhuǎn)移的部位共有5處(見圖1)。組織學(xué)檢查:見移植瘤內(nèi)有成群的密集的未分化上皮細(xì)胞,有豐富的、泡沫樣的嗜酸細(xì)胞象,核內(nèi)有多形的、數(shù)目不均的染色質(zhì),前列腺僅見少許腺樣結(jié)構(gòu)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)是腫瘤細(xì)胞被膜下皮質(zhì)、髓質(zhì)廣泛浸潤(rùn),在許多淋巴結(jié),腫瘤細(xì)胞占據(jù)整個(gè)淋巴結(jié),幾乎一個(gè)淋巴細(xì)胞也見不到。皮下模型組小鼠僅見到腫瘤局部的生長(zhǎng)與浸潤(rùn),未見腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生。四、不同原位模型組小鼠血清中nd皮下模型組小鼠平均生存時(shí)間為(33.0±5.6)d,而原位模型組小鼠僅為(17.0±3.5)d,兩者相比差異有非常顯著性(P<0.01)。原位移植腫瘤細(xì)胞目前的研究多選擇皮下作為前列腺癌的小鼠模型荷瘤部位,雖然有接種方便、易于觀察等優(yōu)點(diǎn),但其生物學(xué)行為往往僅有腫瘤的局限性生長(zhǎng)和浸潤(rùn),難以觀察到重要的淋巴和血道轉(zhuǎn)移行為。有研究表明,超聲低回聲反射陽性時(shí),有41.5%的前列腺癌患者在確診時(shí)已有轉(zhuǎn)移,可見皮下移植瘤模型并不能很好地模擬前列腺癌在人體內(nèi)的自然生長(zhǎng)過程,對(duì)于研究其病理生理過程、判別藥物療效存在較大的局限性。根據(jù)Paget的研究,腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴于一個(gè)合適的微環(huán)境,可以預(yù)見原位種植可能具有更高的致瘤率和轉(zhuǎn)移機(jī)率。Sato等對(duì)比前列腺癌LNCaP細(xì)胞懸液分別作SCID鼠皮下和原位種植后的情況,顯示皮下模型組中100%成瘤,無一發(fā)生淋巴結(jié)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移;原位模型組中89%成瘤,但全部發(fā)生腹膜后和縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,40%發(fā)現(xiàn)有鏡下肺轉(zhuǎn)移。Stephenson等人選用轉(zhuǎn)移特性較強(qiáng)的PC-3M進(jìn)行腫瘤細(xì)胞原位注射,獲得了73%(27/37)的主動(dòng)脈旁淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生率。BastideC等報(bào)道將人的前列腺癌細(xì)胞PC-3和DU-145接種到SCID小鼠體內(nèi)能產(chǎn)生包括淋巴結(jié)、肝、肺、脾、腎和腎上腺在內(nèi)的多個(gè)體內(nèi)部位轉(zhuǎn)移灶。但由于小鼠前列腺很小(約50mg),對(duì)其進(jìn)行腫瘤細(xì)胞注射需要特別精細(xì)的操作,否則很容易溢出而造成人為的腹腔種植,導(dǎo)致模型建立失敗。有研究表明,注入腫瘤細(xì)胞后10min～3h,即使沒有直接刺入血管內(nèi),也容易產(chǎn)生自發(fā)的向淋巴道和血道的轉(zhuǎn)移造成人為的播散。而腫瘤細(xì)胞植入小鼠后,細(xì)胞增殖的前提是有宿主基質(zhì)細(xì)胞穿入瘤體,因此腫瘤基質(zhì)對(duì)于腫瘤生長(zhǎng)有重要作用。有人研究將纖維細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共同培養(yǎng),而觀察到明顯的纖維細(xì)胞刺激腫瘤生長(zhǎng)的作用。所以單純細(xì)胞注射不僅缺少完整的組織結(jié)構(gòu),而且也容易造成腫瘤細(xì)胞的人為播散而非真正的轉(zhuǎn)移。近年來Hoffman等首創(chuàng)外科原位移植技術(shù),利用直接來源于新鮮的外科標(biāo)本或移植性人腫瘤組織,通過手術(shù)原位移植于裸鼠體內(nèi)以建立腫瘤模型的方法。因?yàn)檫@種方法具有原位移植的優(yōu)點(diǎn),同時(shí)又維持了原有腫瘤組織結(jié)構(gòu)及其生物學(xué)特性,因此,移植瘤在裸鼠體內(nèi)能以類似病人體內(nèi)的方式展示其惡性行為,包括轉(zhuǎn)移。該研究組采用改良方法對(duì)該模型進(jìn)行系統(tǒng)性測(cè)試,將5個(gè)1mm3左右PC-3小瘤塊接種到裸鼠切開的腹側(cè)前列腺左右葉中間部位,3個(gè)月后前列腺腫瘤發(fā)生率為19/20(95%),形成腫瘤直徑均大于2cm,使小鼠腹部發(fā)生變形。主動(dòng)脈旁淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率達(dá)13/19(68%),且有5/19(26%)小鼠發(fā)生了肺轉(zhuǎn)移。但由于受選擇腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性(惡性程度較低)所決定,模型制作耗時(shí)較長(zhǎng)而且轉(zhuǎn)移發(fā)生率不是很高。本研究采用鼠源性的RM-1細(xì)胞系建立的C57BL6近交系小鼠前列腺癌原位移植瘤模型,模型組的小鼠全部發(fā)生轉(zhuǎn)移,其中盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生率最高,為16/16,由血行途徑而致的各主要臟器轉(zhuǎn)移灶中,肺的發(fā)生率最高,為8/16,高于文獻(xiàn)報(bào)道,同時(shí)原位模型組小鼠的平均生存期明顯低于皮下模型組,亦表明前者較后者更接近于晚期或轉(zhuǎn)移性人癌體內(nèi)的真實(shí)情況。前