熱休克蛋白60和熱休克蛋白70在口腔扁平苔蘚病變中的表達(dá)

熱休克蛋白60和熱休克蛋白70在口腔扁平苔蘚病變中的表達(dá)

扁平苔蘚（pmi）是一種常見(jiàn)的皮膚粘膜疾病。雖然近年研究表明T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)對(duì)LP的發(fā)病起了重要作用,但其發(fā)病機(jī)制仍不明確。熱休克蛋白(heatshockprotein,HSP)又稱(chēng)應(yīng)激蛋白(stressprotein,SP),是一類(lèi)非常保守的蛋白質(zhì)分子家族,自從20世紀(jì)80年代確定HSP的序列和基因結(jié)構(gòu)位點(diǎn)以來(lái),很多研究發(fā)現(xiàn),HSP在細(xì)胞保護(hù)、免疫應(yīng)答、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及調(diào)節(jié)凋亡等方面具有重要作用,并且發(fā)現(xiàn)HSP參與某些疾病的發(fā)病過(guò)程。但是,對(duì)HSP在口腔LP(oralLP,OLP)中的表達(dá)和作用的研究較少,為此,我們探討了HSP60及HSP70在OLP病變中的作用。數(shù)據(jù)和方法1.hsp60的免疫組織化學(xué)選取北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院病理科1998～2001年存檔的OLP標(biāo)本62例(其中糜爛型14例、非糜爛型48例),慢性盤(pán)狀紅斑狼瘡21例,粘膜良性淋巴組織增生病10例,白斑10例進(jìn)行HSP60的免疫組織化學(xué)研究。HSP70研究所用白斑標(biāo)本為46例(單純?cè)錾?2例,輕度異常增生13例,中度異常增生11例,重度異常增生10例)。標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛固定、常規(guī)石蠟包埋。用于RT-PCR的組織為取自典型OLP病損區(qū)的新鮮組織,沿組織長(zhǎng)徑中線分切標(biāo)本,一半組織用于HE染色確診,一半迅速置-70℃冰箱凍存。正常粘膜5例,-70℃凍存。標(biāo)本經(jīng)組織學(xué)證實(shí)為典型的OLP,且均是未經(jīng)激光、激素、免疫調(diào)節(jié)治療,不伴其他口腔感染性疾患的原發(fā)病例。正常粘膜取自健康人口腔粘膜。2.小鼠igg、過(guò)氧化物酶鏈親和素及免疫基化微波處理行抗原修復(fù)。試劑:鼠抗人HSP60單克隆抗體為邁新公司產(chǎn)品;生物素化馬抗小鼠IgG、過(guò)氧化物酶鏈親和素購(gòu)自中山公司。結(jié)果判定:以胞核或胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性。陽(yáng)性對(duì)照片明顯著色,陰性對(duì)照無(wú)著色。染色強(qiáng)度分為兩個(gè)級(jí)別:胞核或胞質(zhì)中出現(xiàn)淺棕黃色顆粒為弱陽(yáng)性;出現(xiàn)深棕黃色顆粒為強(qiáng)陽(yáng)性。3.pcr擴(kuò)增周期引物:HSP60(擴(kuò)增產(chǎn)物為190bp)上游引物:5′ATGTTATCGAGATTGTGTGGGAA3′,下游引物:5′TACGCAATGCACGATTACTG3′。HSP70(擴(kuò)增產(chǎn)物為550bp)上游引物:5′AATAATAGTAAAGATCACAAAGT3′,下游引物:5′TAATTTCATTAACTTCAACTTCACT3,均以β-actin(擴(kuò)增產(chǎn)物為300bp)作為內(nèi)對(duì)照,其上游引物:5′CATCTCTTGCTCGAAGTCCA3′,下游引物:5′ATCATGTTTGAGACCTTCAACA3′。PCR循環(huán)25個(gè)周期。其產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳,采用GelPro3.0灰度分析軟件分析結(jié)果,得到目的基因與β-actin的灰度值及二者的比值。4.統(tǒng)計(jì)評(píng)估用SAS軟件精確概率法和t檢驗(yàn)對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果一、hsp60表達(dá)1.正?？谇徽衬ど掀ぜ?xì)胞和結(jié)締組織為陰性。2.OLP病損區(qū)的陽(yáng)性表達(dá)見(jiàn)于上皮基底細(xì)胞、棘層細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)。固有層浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞可見(jiàn)弱陽(yáng)性表達(dá)。3.慢性盤(pán)狀紅斑狼瘡、粘膜良性淋巴組織增生病、白斑以陰性表達(dá)為主,弱陽(yáng)性表達(dá)偶見(jiàn)于上皮基底細(xì)胞、棘層細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)。4.統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果:①LP與其他各組相比,HSP60陽(yáng)性率和染色強(qiáng)度的差異有顯著性,P<0.001。②糜爛型LP和非糜爛型LP之間陽(yáng)性率和染色強(qiáng)度間差異無(wú)顯著性,P>0.05。非扁平苔蘚的各組之間差異無(wú)顯著性。二、hfs70免疫組的染色特征表2和表31.正常粘膜上皮基底細(xì)胞的胞核和胞質(zhì)呈弱陽(yáng)性表達(dá),染色均勻。2.膠質(zhì)細(xì)胞的染色HSP70陽(yáng)性表達(dá)見(jiàn)于上皮基底細(xì)胞、棘層細(xì)胞的細(xì)胞核及胞質(zhì)內(nèi),上皮層著色方式有兩種:連續(xù)著色、灶性著色。固有層內(nèi)淋巴細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞有陽(yáng)性著色。3.染色強(qiáng)度不一致陽(yáng)性表達(dá)見(jiàn)于上皮基底細(xì)胞、棘層細(xì)胞,著色強(qiáng)度不一致。單純?cè)錾洼p度異常增生可見(jiàn)淋巴細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá),中-重度異常增生淋巴細(xì)胞染色強(qiáng)度下降。4.粘膜良性淋巴結(jié)組織增生陽(yáng)性表達(dá)偶見(jiàn)于上皮基底細(xì)胞。5.慢性狼型個(gè)別病例的上皮細(xì)胞呈弱陽(yáng)性表達(dá)。6.輸注后淋巴hsp80表達(dá)①糜爛型LP上皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞染色陽(yáng)性率和染色強(qiáng)度下調(diào),與非糜爛型相比差異有顯著性,P<0.001。②粘膜良性淋巴組織增生病、慢性盤(pán)狀紅斑狼瘡的HSP70以陰性表達(dá)為主,均與非糜爛型LP間差異有顯著性,P<0.001。③白斑各組上皮細(xì)胞染色強(qiáng)度不均一,與糜爛型LP間差異有顯著性。④白斑各組淋巴細(xì)胞HSP70表達(dá)陽(yáng)性率與非糜爛型LP相比差異有顯著性。淋巴細(xì)胞染色強(qiáng)度在重度異常增生時(shí)減弱,與糜爛型和非糜爛型LP相比差異均有顯著性,P<0.001。三、mrna/-actin水平的分析OLP(12例)和正常粘膜(5例)HSP60mRNA/β-actin水平的灰度比值分別為0.75±0.026、0.86±0.062,兩組相比差異有顯著性,P<0.001。四、mrna/-actin水平的分析OLP(12例)和正常粘膜(5例)HSP70mRNA/β-actin水平的灰度比值分別為0.674±0.027、0.80±0.063,兩組相比差異有顯著性,P<0.001。hsp60在病理變化和病理生理中的表達(dá)HSP是生物界廣泛存在的高度保守的蛋白質(zhì)家族,具有致病和保護(hù)、預(yù)防雙重性質(zhì)。近年來(lái)有研究表明HSP參與某些疾病的發(fā)生,尤其是HSP60和HSP70家族。本研究結(jié)果顯示,OLP的HSP60表達(dá)的陽(yáng)性率、染色強(qiáng)度與正常粘膜、慢性盤(pán)狀紅斑狼瘡、粘膜良性淋巴組織增生病相比差異存在顯著性(P<0.001)。HSP60在OLP病損區(qū)表達(dá)以上皮層細(xì)胞強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)為主,固有層浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞有弱陽(yáng)性表達(dá)、血管為陰性?；啄げ磺逦?基底細(xì)胞液化嚴(yán)重的區(qū)域染色強(qiáng)度下降。這些結(jié)果與Chaiyarit的發(fā)現(xiàn)有一定的一致性。免疫組化結(jié)果提示,HSP60在OLP中的表達(dá)存在較為特異的一面,有不可忽視的作用。一些研究發(fā)現(xiàn)OLP與細(xì)菌病毒感染有關(guān),而LP病損區(qū)上皮基底細(xì)胞、棘層細(xì)胞的HSP60強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)說(shuō)明該病存在明顯的應(yīng)激因素,這種應(yīng)激因素有可能來(lái)自細(xì)菌或病毒感染或其他刺激。Sugerman等提取OLP患者病損區(qū)的淋巴細(xì)胞,用HSP60刺激培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)了淋巴細(xì)胞的增殖。可能由于HSP的高度保守性,人體T細(xì)胞在識(shí)別、攻擊外來(lái)抗原的同時(shí)將過(guò)度表達(dá)HSP60的上皮角質(zhì)形成細(xì)胞也作為靶細(xì)胞,造成上皮基底細(xì)胞的破壞。因此,HSP60在病損區(qū)上皮細(xì)胞的強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)可能是病變過(guò)程中的一個(gè)重要事件,提示OLP具有自身免疫性疾病的特點(diǎn)。HSP70是HSP家族中行使保護(hù)功能的主力軍,它在OLP上皮層可連續(xù)著色或灶性著色。上皮可以表現(xiàn)為全層連續(xù)著色,以基底細(xì)胞、棘層細(xì)胞為主,基底細(xì)胞通?？梢?jiàn)細(xì)胞核的陽(yáng)性表達(dá)。固有層浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞也呈現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)。有研究表明,在應(yīng)激狀態(tài)下,HSP70會(huì)在細(xì)胞核高表達(dá),起保護(hù)作用。外來(lái)刺激,如細(xì)菌、病毒感染,不良理化刺激都有上調(diào)HSP的可能。LP固有層結(jié)締組織浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞的HSP70陽(yáng)性表達(dá)說(shuō)明了浸潤(rùn)之淋巴細(xì)胞處于一種特殊的狀態(tài),是否淋巴細(xì)胞過(guò)度表達(dá)HSP70而失去了正常的凋亡程序,使其過(guò)度發(fā)揮作用而加重致病作用,尚需進(jìn)一步研究。HSP70的表達(dá)上調(diào)還發(fā)生在LP淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)密集的周?chē)鷧^(qū)域。本研究中這些區(qū)域上皮基底細(xì)胞HSP70的表達(dá)強(qiáng)度較正常粘膜升高,這可能是由于淋巴細(xì)胞的活化和浸潤(rùn)產(chǎn)生了大量的細(xì)胞因子,刺激了這些區(qū)域的上皮細(xì)胞。白斑病變中,上皮細(xì)胞染色陽(yáng)性率隨異常增生程度的增加而降低,中度異常增生和重度異常增生的病例固有層的炎癥細(xì)胞HSP70為陰性。這從另一個(gè)角度說(shuō)明了OLP和白斑的發(fā)病過(guò)程有本質(zhì)差別。而白斑單純?cè)錾洼p度異常增生的病例中淋巴細(xì)胞有HSP70的陽(yáng)性表達(dá),提示在上皮細(xì)胞發(fā)生改變的早期可能存在與刺激和炎癥反應(yīng)有關(guān)的某個(gè)過(guò)程。HSP70主要體現(xiàn)著機(jī)體對(duì)刺激的反應(yīng)和保護(hù)機(jī)制,其表達(dá)方式和特點(diǎn)有很多不同之處。正常粘膜HSP70的弱陽(yáng)性表達(dá)說(shuō)明了正?？谇徽衬ひ灿休p度刺激因素存在,HSP70的弱陽(yáng)性表達(dá)起到了恰當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)作用。糜爛型LP的HSP70下調(diào)說(shuō)明糜爛型LP的細(xì)胞保護(hù)機(jī)制受損,缺乏必要的細(xì)胞保護(hù)作用。粘膜表面糜爛,失去了保護(hù)屏障,使組織接受到的刺激強(qiáng)度增大,可能由于長(zhǎng)期反復(fù)的刺激使細(xì)胞耐受刺激的域值升高或其他復(fù)雜的機(jī)制,使HSP70陽(yáng)性表達(dá)反而降低。而細(xì)胞保護(hù)機(jī)制的降低又會(huì)加重病情。糜爛型LP病情遷延波動(dòng)可能與缺乏恰當(dāng)?shù)募?xì)胞保護(hù)機(jī)制有關(guān)。HSP70的表達(dá)特點(diǎn)說(shuō)明其在應(yīng)激和疾病發(fā)生中起著雙重作用,可能主要體現(xiàn)著分子保護(hù)機(jī)制。HSP基因的表達(dá)、轉(zhuǎn)錄、