基于ril群體的抗綠豆象基因檢測與分析

基于ril群體的抗綠豆象基因檢測與分析

豆象是對豆類和其他豆類植物的嚴重警告，主要包括綠色豆象、三葉豆象和灰豆象。其中，綠色豆象和四狀豆象受到的破壞最大。在綠豆1個生活周期內(nèi),因豆象危害可損失產(chǎn)量30%～56%,如再次侵染危害更重,甚至整倉綠豆受損。選育抗豆象綠豆品種是防治豆象危害的最佳途徑。20世紀80年代以來,日本、泰國、澳大利亞等國的食用豆類遺傳育種學(xué)家致力于抗豆象基因的發(fā)掘和利用。目前篩選出的抗豆象綠豆基因資源主要有馬達加斯加野生種TC1966、印度栽培種V2709、菲律賓栽培種V2802和澳大利亞野生種ACC41。TC1966高抗綠豆象和四紋豆象,是研究最多的抗源。早在1988年,就有研究表明TC1966對豆象的抗性由顯性單基因控制,并用于分子標記作圖和抗性育種。V2709和V2802均抗綠豆象和四紋豆象,抗性均由1個主效顯性基因控制,且很可能在同一位點。目前,還未見有關(guān)綠豆抗豆象QTL分析的研究報道。Kaga等利用飯豆和小豆雜交的中間作圖群體在第2連鎖群上檢測到1個抗綠豆象主效QTL。Somta等利用栽培飯豆[Vignaumbellate(Thunb.)Ohwi&Ohashi]與野生小豆[Vignanakashimae(Ohwi)Ohwi&Ohashi]雜交F2代作圖群體,對不同發(fā)育時期的綠豆象和四紋豆象進行動態(tài)QTL檢測和遺傳效應(yīng)分析,結(jié)果在第7連鎖群上檢測到1個穩(wěn)定的抗綠豆象主效QTL,在第3連鎖群上檢測到1個穩(wěn)定的抗四紋豆象主效QTL。重組近交系經(jīng)過多代連續(xù)自交,家系內(nèi)基因型基本純合,以近交系內(nèi)一定數(shù)目的單株表現(xiàn)平均值作為該近交系的表現(xiàn)型值,可獲得相對準確的表現(xiàn)型數(shù)據(jù),適合多環(huán)境重復(fù)試驗,是QTL定位的理想群體。為了在綠豆中尋找抗綠豆象基因,本試驗以Berken/ACC41獲得的重組近交系群體為材料,通過室內(nèi)人工接蟲鑒定,評價其對綠豆象的抗性表現(xiàn),結(jié)合分子標記連鎖圖譜,進行綠豆象抗性QTL的檢測和遺傳效應(yīng)分析。1材料和方法1.1群體材料的選擇母本Berken(Vignaradiatassp.radiata)由美國俄克拉何馬州立大學(xué)JamesKirby博士培育,對豆象高感(100%感);父本ACC41(Vignaradiatassp.sublobata)是1984年澳大利亞Lawn博士在昆士蘭州的薩默塞特奧馬鎮(zhèn)(經(jīng)度152°33′,緯度27°7′)發(fā)現(xiàn)的1個野生綠豆材料,為多年蔓生類型,莖稈纖細,農(nóng)藝性狀與栽培綠豆有很大差異,對豆象高抗(100%抗)。從Berken/ACC41亞種內(nèi)雜交F2代開始,利用單粒傳方法得到包含227個F8家系的RIL群體。為保存種質(zhì),在保證家系內(nèi)種子質(zhì)量和群體結(jié)構(gòu)仍為隨機群體的情況下,分別選取2000年在澳大利亞大田收獲的2個重復(fù)各為210個和217個家系的F8RIL群體為試驗材料。并于2005年將其中1個重復(fù)的210個F8RIL分別在北京及南京種植收獲F9RIL群體。由于受天氣和土壤因素的影響,有些家系出苗不齊,還有些家系對光溫反應(yīng)敏感,未能正常開花結(jié)實,北京和南京獲得完整試驗結(jié)果的家系數(shù)較少,分別為72個和59個家系,因此只將北京和南京材料作為參考。種植地點和接蟲時間的不同組合構(gòu)成4個環(huán)境處理,即:澳大利亞2005,澳大利亞2006,北京2006和南京2006。1.2家系和種子種2000年2月,在澳大利亞昆士蘭州的澳大利亞聯(lián)邦科學(xué)與工業(yè)研究組織植物研究所(CSIROPlantIndustry)種植F7RIL群體,完全隨機區(qū)組設(shè)計,3個重復(fù),同一區(qū)組內(nèi),每個家系8粒種子,種成0.4m×0.4m的小區(qū),在小區(qū)的每個頂角種2粒種子,小區(qū)間隔1m,30d后間苗,每個頂角剩1個植株,成熟時每個重復(fù)按小區(qū)分別收獲F8家系的種子。2005年7月,將210個F8家系分別種植在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所(北京)和江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所(南京)試驗場,每個家系40粒種子,完全隨機區(qū)組設(shè)計,2個重復(fù),每個區(qū)組內(nèi),每個家系20粒種子種成1行,行長1.5m,行距0.5m。成熟時每小區(qū)按家系分別收獲10個單株的種子,剩余單株按家系混收。1.3收集綠豆象,放養(yǎng)抗蟲鑒定2005年7月及2006年7月,從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所倉庫內(nèi)收集綠豆象,帶回實驗室用感豆象品種中綠1號種子飼喂,繁殖的豆象用于抗蟲鑒定。1.4種子受害調(diào)查采用國家科技攻關(guān)項目選用的室內(nèi)人工接蟲方法。于2005年7月,將210個澳大利F8RIL及其親本Berken和ACC41接蟲;于2006年7月將217個澳大利亞F8RIL及在北京和南京分別收獲的72個和59個F9RIL及其親本Berken和ACC41接蟲。2年接蟲均用中綠1號作對照,設(shè)2個重復(fù)。從每個家系中隨機選取60粒健康種子分成2份,每份30粒,分別放入直徑6cm和高1cm的小塑料盒,不加蓋放入大塑料盒(66cm×44cm×18cm),上蓋2層黑布,置養(yǎng)蟲架上。養(yǎng)蟲溫度控制在(27±2)℃,并保持黑暗和相對高濕。每個大塑料盒中放入400～500對剛羽化1～3d的成蟲,平均每份被鑒定材料8對,令其隨機產(chǎn)卵,至感蟲親本每粒種子著卵量約5粒以上時,除去成蟲,將已接蟲材料繼續(xù)培養(yǎng)在養(yǎng)蟲室。接蟲40～45d后,當(dāng)對照中綠1號種子受害率達100%時,調(diào)查每份材料的受害粒數(shù),換算成種子受害率。公式為:SDR=ΣNSDN×100%SDR=ΣΝSDΝ×100%式中,SDR:種子受害率(%),NSD:受害種子數(shù),N:鑒定種子總數(shù)。1.5最佳工藝條件的確定及顯著性檢測遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建見文獻。圖譜中的79個RFLP分子標記均勻的分布于13個連鎖群上。個體來源于ACC41染色體區(qū)段的占個體基因組的12.39%～74.34%,來源于Berken染色體區(qū)段的占個體基因組的25.66%～87.61%,ACC41基因占整個群體基因組成的43.70%,Berken基因占56.30%,χ2測驗顯示群體組成符合1∶1的分離比例(χ2=0.67<χ20.05,1=3.84),表明該群體是一個隨機群體,適合進行QTL定位。在79個位點中,29個位點出現(xiàn)偏分離(1∶1),其中24個位點表現(xiàn)0.05水平的極顯著偏分離(占30.38%),5個位點表現(xiàn)0.01水平的極顯著偏分離(占6.33%),分布在除第7、8、10外的10條連鎖群。這13條連鎖群覆蓋了綠豆基因組約684.7cM,其中最短連鎖群5.6cM,最長連鎖群85.9cM,標記間平均距離為10.4cM,最大距離為20.7cM。利用WinQTLCart軟件進行復(fù)合區(qū)間作圖(compositeintervalmapping,CIM)。CIM分析時應(yīng)用Basten等模型6的向后逐步回歸的方法,選擇5個控制標記,窗口大小為10cM。用軟件MapDraw繪制遺傳圖譜。將LOD值3.0作為出現(xiàn)QTL的檢測標準,用這樣的閾值在綠豆基因組中檢測1個錯誤QTL的幾率大約只有0.05。2結(jié)果與分析2.1抗豆象性狀在環(huán)境間的分離和抗感兩親本Berken和ACC41抗性差異極顯著,其中Berken在2005年7月和2006年7月接蟲中種子受害率都為100%,而ACC41種子受害率均為0。由表1可見,RIL群體種子受害率在0～100%均有分布。在2005年7月接蟲試驗中,210個澳大利亞RIL種子受害最輕,平均受害率為52.55%±42.06%;2006年7月接蟲試驗中,217個澳大利亞RIL種子平均受害率與2005年7月接蟲的210個澳大利亞RIL種子平均受害率接近,為52.99%±46.72%;72個北京RIL種子受害最重,平均受害率為75.93%±36.32%;59個南京RIL種子受害程度居中,平均受害率為62.04%±41.73%。由圖1可見,4個環(huán)境條件下RIL群體的抗豆象性狀均表現(xiàn)偏分離。以50%為界限,將RIL按性狀值分為2組,即抗(受害率≤50%)和感(受害率>50%)。家系數(shù)經(jīng)卡平方適合性測驗結(jié)果表明,除北京2006RIL群體抗∶感不符合1∶1分離比例外(χ2=10.56>χ20.05,1=3.84),其他3個環(huán)境下的RIL群體抗∶感均符合1∶1的分離比例,(澳大利亞2005RIL群體,χ2=2.29<χ20.05,1=3.84;澳大利亞2006RIL群體,χ2=0.23<χ20.05,1=3.84;南京2006RIL群體,χ2=2.75<χ20.05,1=3.84),說明Berken和ACC41組合存在主基因的分離,適合用來進行基因定位。2.2抗綠豆象各微量元素的遺傳多樣性應(yīng)用WindowsQTLCartographer2.0對4個環(huán)境條件下的RIL群體進行QTL檢測和遺傳效應(yīng)分析。結(jié)果表明,在4個環(huán)境條件下,RIL群體均在第9連鎖群上mgM213～VrCS161標記之間檢測到1個抗綠豆象QTL,其LOD在12.99～82.74,解釋表型變異的74.05%～79.27%,距離左翼標記mgM213的距離為4.0～8.0cM。該QTL的加性效應(yīng)為負值,表明來自母本Berken的該位點等位基因可增加種子受害率的40.75%～45.18%,即抗性等位基因來自父本ACC41(表2,圖2)。按照Humphry對QTL的命名方法,將位于第9連鎖群的該QTL命名為BrI(圖3)。3個環(huán)境條件下ril群體克氏原螯蝦種子基因座和抗綠豆象基因?qū)ζ淇剐院突蜃兓饔敏箤偈秤枚诡愂莵喼?、非洲等許多國家的主要糧飼作物,但豆象對豇豆屬作物的危害非常嚴重,培育抗豆象品種是減少危害最經(jīng)濟有效的方法。TC1966是最受各國重視的抗豆象綠豆野生資源,但Miura等用TC1966和感豆象親本“OsakaRyokutou”雜交后代材料B14F17飼喂小鼠,發(fā)現(xiàn)小鼠血液生物化學(xué)值發(fā)生變化,因此培育帶有TC1966抗性基因的品種對人類的安全性還需進一步研究。本研究選用ACC41作為試驗材料,以期為抗性育種提供新的抗豆象基因資源。本試驗表明,RIL群體在4個環(huán)境下種子受害率均呈現(xiàn)偏分離,卡平方適合性測驗顯示除北京2006RIL群體外,其他3個環(huán)境下的RIL群體抗∶感均符合1∶1的分離比例,說明存在1個抗綠豆象的主效基因。QTL作圖分析也表明4個環(huán)境條件下RIL群體都在第9連鎖群mgM213～VrCS161標記之間檢測到1個抗綠豆象基因座,特別是北京和南京分別收獲了72個和59個家系,其理論上已不是隨機群體,盡管如此,也在該區(qū)域檢測到抗綠豆象基因,表明該基因座是1個對綠豆象抗性起重要作用的穩(wěn)定表達的抗性基因位點。其在4個環(huán)境下解釋的表型變異達到74.05%～79.27%,是抗豆象的主效QTL。多年來食用豆類育種學(xué)家研究認為豇豆屬對豆象的抗性為單基因或寡基因遺傳。黑吉豆對綠豆象的抗性由1個隱性基因控制;野生黑吉豆對四紋豆象的抗性由復(fù)基因控制;豇豆對綠豆象的抗性由2個隱性基因控制。不過Somta等認為栽培綠豆V2709和V2802對綠豆象和四紋豆象的抗性雖由1個顯性主基因控制,但也存在抗性百分數(shù)呈現(xiàn)連續(xù)分布的數(shù)量遺傳特點。本試驗中4個環(huán)境條件下RIL群體種子受害率在0～100%呈現(xiàn)連續(xù)分布,也表明抗綠豆象有數(shù)量遺傳特點。Young等的研究表明野生綠豆TC1966由1個主效基因控制,該主效基因解釋表型變異的87%,還存在微效基因的作用,主基因和微效基因的總和才能解釋表型的全部變異。本研究中BrI解釋了表型變異的74.05%～79.27%,也說明還有一些微效QTL的存在,如果將LOD降到2.5以下,還能在其他連鎖群檢測到一些微效QTL。QTL分析還表明RIL群體在4個環(huán)境條件下檢測到的主效QTLBrI與左側(cè)標記間的距離均在10cM以下。因此,有必要在初級定位的基礎(chǔ)上,使含有目標QTL的染色體