外來入侵種松材線蟲近交系培育的遺傳效應(yīng)

外來入侵種松材線蟲近交系培育的遺傳效應(yīng)

外來入侵物種影響非常大。在入侵地點，已經(jīng)成為生物多樣性喪失和物種危機的重要因素，但在原產(chǎn)地，它通常是非常危險的。生境的變遷使入侵種呈現(xiàn)出一定的適應(yīng)性進化,例如形態(tài)、生活史、生態(tài)位、行為等發(fā)生改變。其中,繁殖能力增強是比較普遍的入侵種表型。對入侵生物繁殖力改變的遺傳學(xué)基礎(chǔ)進行研究對生物入侵機制的闡明極為重要。近交系具有高度純合的基因型和穩(wěn)定的遺傳性狀,有益于實驗結(jié)果的精確性和重復(fù)性,因此,近交系的培育成為遺傳學(xué)研究的基礎(chǔ)。但是入侵地和原產(chǎn)地種群的近交系培育以及二者之間的比較極少報道。松材線蟲起源于北美,入侵中國后,已成為我國最危險的森林害蟲之一,造成松樹的大量死亡,但是在原產(chǎn)地北美危害并不嚴(yán)重,具有典型的入侵種表現(xiàn)特征。松樹死亡率主要由松材線蟲繁殖能力決定,因此松材線蟲近交系培育及繁殖能力比較成為闡明松材線蟲遺傳學(xué)基礎(chǔ)的關(guān)鍵。謝丙炎等曾對比過中國和美國各種群的microRNA、低溫適應(yīng)等特征。本實驗選擇這些研究中具有代表性的中國和美國兩個松材線蟲地方種群進行研究,包括對中國浙江舟山松材線蟲種群和美國賓夕法尼亞州松材線蟲種群進行近交系培育,并對其近交系培育前、后繁殖力的差異進行比較。1培養(yǎng)灰葡萄孢菌體1.1松材線蟲中國浙江舟山松材線蟲種群(CN-ZJ)采自于中國浙江舟山(1992年于該地首次發(fā)現(xiàn)松材線蟲);美國賓夕法尼亞州松材線蟲種群(US-7H)由北京師范大學(xué)成新躍教授提供,采于美國賓夕法尼亞州,使用前均培養(yǎng)在灰葡萄孢菌(Botrytiscinema)上。1.2灰葡萄孢的培養(yǎng)配制PDA培養(yǎng)基,PDA(BD公司提供)39g,蒸餾水1000mL,然后在121℃下,滅菌30min,倒入90mm直徑培養(yǎng)皿中;將灰葡萄孢接種于培養(yǎng)基上,25℃,培養(yǎng)1周,待用。1.3CN-ZJ和US7H近交系的培育將兩個松材線蟲種群的第4齡幼蟲用10μL移液器分別隨機吸取50對(1雌1雄),編號為CN(1—50),US(1—50),每對各自接種于35mm培養(yǎng)皿中直徑為5mm的灰葡萄孢菌塊上,25℃培養(yǎng)5d后,向培養(yǎng)皿中注入5mL無菌蒸餾水,將菌塊翻過來,靜置2h后,取出菌塊,對培養(yǎng)皿內(nèi)松材線蟲進行數(shù)量統(tǒng)計,然后取該世代4齡松材線蟲幼蟲成對培養(yǎng),編號(圖1)。如此往復(fù)循環(huán)12個周期后,將形成的各株系松材線蟲接入大麥培養(yǎng)基灰葡萄孢菌進行培養(yǎng),-80℃冷凍保存待用。1.5數(shù)據(jù)使用SPSS18.0進行統(tǒng)計分析,運用獨立樣本t檢驗對比處理間差異。2結(jié)果與分析2.1基因組的篩選25℃培養(yǎng)松材線蟲5d后,無菌水沖出,發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)皿中的線蟲有以下幾種情況:1)沒有活體線蟲;2)只有活體雄蟲;3)只有活體雌蟲;4)除父母本外的幼蟲子代。只可選取第4種情況可分辨性別的第4齡幼蟲個體進行轉(zhuǎn)接,經(jīng)過12個世代的近交系轉(zhuǎn)接,CN-ZJ和US7H成功的有4株:CN-ZJG12US7HG12最終CN-ZJ形成4個株系,US7H形成8個株系。得到的CN-ZJ和US7H株系,前10代編號相同,可以初步推測CN-ZJ形成的這4株均來自于第11代親本,遺傳學(xué)背景相同;US7H形成的這8株均來自于第10代親本,遺傳背景相同?？梢钥闯?CN-ZJ和US7H近交成功率均很低。2.2cn-zj和us7h在鄰近交系培養(yǎng)過程中的差異2.2.1cn-zj親本總數(shù)量由圖2看出,US7H親本總數(shù)量(4齡幼蟲數(shù)量),由第1代到第4代先上升,后下降,第4到第7代之間趨于穩(wěn)定,第9代達到高峰;CN-ZJ親本總數(shù)量則是持續(xù)下降到第5代,然后有所波動,第9代到第12代呈連續(xù)下降趨勢。CN-ZJ和US7H在近交系培育的過程中,US7H交配成功率要明顯優(yōu)于CN-ZJ,從第2代開始,親本數(shù)逐步高于US7H,雖然在第6代上,數(shù)量上有所接近,但是隨后,US7H親本數(shù)又明顯高于CN-ZJ。2.2.2cn-zj和us7h近交繁殖檢測從圖3中得知,CN-ZJ和US7H在近交系培育過程中單對親本培養(yǎng)5天后,子代平均數(shù)量上下波動,呈動態(tài)變化。US7H子代數(shù)量從第1代到第3代有所下降,但第6代上升達到峰值,然后呈波動式下降;CN-ZJ子代數(shù)量在前5代先下降,在第6代達到最大數(shù)量,第11代為最小值,第12代有所回升。CN-ZJ和US7H近交系培育過程中第一代到第12代,子代數(shù)量基本重疊在一起,最大值也比較接近,無顯著差異。其中,前5代是CN-ZJ和US7H共同的繁殖急速下降期,從第6代開始突破了近交繁殖死亡的影響,開始有比較穩(wěn)定的繁殖力,偶爾出現(xiàn)繁殖力急速下降的時期,比如CN-ZJ的第11代,US7H的第12代。經(jīng)過SPSS統(tǒng)計分析,CN-ZJ和US7H在近交系培育的前、中、后期,單對親本的平均子代數(shù)量無顯著性差異。2.3野生型的培養(yǎng)通過對CN-ZJ和US7H近交系與野生型各80頭進行培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)近交系與野生型之間沒有顯著性差異,但是CN-ZJ繁殖力顯著高于US7H。3基因遺傳多樣性研究表明,多數(shù)物種近交系的培育會造成等位基因丟失、雜合度逐漸降低、適合度下降以及近交衰退的現(xiàn)象。但是越來越多的研究表明近交系的培育并不一定能造成近交衰退現(xiàn)象。首先,本研究表明,在松材線蟲近交系培育前后,單對親本5d后代數(shù)量以及接種80頭群體培養(yǎng)10d后的種群數(shù)量均未表現(xiàn)出顯著差異。另外,朱麗華等研究表明,松材線蟲近交系培育過程中,致病力未產(chǎn)生顯著變化。因此,推測松材線蟲無近交衰退現(xiàn)象。此外,秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)是雌雄同體,其近交系培育相對容易,壽命、卵大小、及其它生活史指標(biāo)也沒有表現(xiàn)出近交衰退現(xiàn)象,反而會表現(xiàn)出遠交衰退,其近交系表現(xiàn)出比遠交系較高的后代數(shù)目和適合度;無獨有偶,雌雄異體的粉蠹蟲(Lyctusbranneus)近交系后代數(shù)量和適合度也沒有下降,而遠交系卻表現(xiàn)出孵化率下降的特點。入侵地和原產(chǎn)地繁殖能力常常會有所提高。ShoubridgeEA等研究表明,美洲西鯡(Alosasapidissima)作為北美入侵物種,在原產(chǎn)地,雌性個體一個生命周期內(nèi)繁殖數(shù)量約為30000左右,但是到入侵地后,其繁殖數(shù)量則變?yōu)?21000—50000,CN-ZJ和US7H之間,雖然單對親本后代數(shù)量(培養(yǎng)5d)在近交系培育前后并沒有顯著性差異,但是,群體培養(yǎng)(接種量為80頭/皿,培養(yǎng)10d)繁殖數(shù)量上卻有顯著差異,CN-ZJ繁殖力更高。此現(xiàn)象的產(chǎn)生,可能與US7H含有更多的4齡幼蟲,而CN-ZJ含有更多的低齡幼蟲有關(guān)(圖2)。CN-ZJ年齡結(jié)構(gòu)更趨向于正三角形,更為年輕化,后繼發(fā)展較好。這種在入侵地繁殖力的提高是否具有普遍性,是否與交配策略發(fā)生改變,產(chǎn)生適應(yīng)性進化等有關(guān)需要進一步深入研究。目前正在采集原產(chǎn)地北美,和入侵地日本、中國、歐盟各國等地多個種群,準(zhǔn)備進行遺傳學(xué)分析和比較,闡明松材線蟲入侵過程中繁殖力提高的遺傳學(xué)基礎(chǔ)。US7H和CN-ZJ近交系培育成功率較低,其中,US7H形成了8個株系,CN-ZJ形成了4個株系。CN-ZJ和US7H在近交系培育過程的前期繁殖力出現(xiàn)急速下降的情況,可能是因為近交系培育初期致死基因影響很大,而培育后期松材線蟲突破了近交的遺傳瓶頸。從第6代后,US7H每代親本數(shù)量高于CN-ZJ,尤其第12代接種數(shù)量達到60,而CN-ZJ不足10,由此推測US7H近交系培育過程中具有更強的突破致死基因影響的能力。由此推測,當(dāng)少量松材線蟲入侵到一片松林時,由于其快速繁殖和生長的特點(5—6d1代),雖然小種群侵染寄主松樹具有近交遺傳瓶頸,但是,入侵當(dāng)年2到3個月的繁殖時間(10—15代)足以使其突破致死基因影響,突破小種群瓶頸效應(yīng),最終獲得較大的種群數(shù)量,加大了其繼續(xù)傳播到更多健康松樹的機率,促進了自身的入侵成功。另外,成飛雪等發(fā)現(xiàn)中國和美國松材線蟲間存在著一些遺傳多樣性差異,不同種群突破近交遺傳瓶頸出現(xiàn)難易差異現(xiàn)象,是否與其遺傳多樣性差異有關(guān),有待進一步分析。1.4CN-ZJ和US7H近交系和野生型繁殖力的測定向培養(yǎng)好的灰葡萄孢中分別接入CN-ZJ和US-7H自交系和野生型松材線蟲80頭,各10次重復(fù),培養(yǎng)10d,用貝爾曼漏斗法進行分離后,顯微鏡下進行觀察和數(shù)量統(tǒng)計。45-1-2-5-4-1-3-1-5-3-4-2(CN-ZJG10-4-2)45-1-2-5-4-1-3-1-5-3-4-4(CN-ZJG10-4-4)45-1-2-5-4-1-3-1-5-3-4-5(CN-ZJG10-4-5)45-1-2-5-4-1-3-1-5-3-4-7(CN-ZJG10-4-7)US7H成功的有8株:34-4-3-1-1-1-1-6-1-1-5-4(US7HG10-5-4)34-4-3-1-1-1-1-6-1-1-5-5(US7HG10-5-5)34-4-3-1-1-1-1-6-1-1-5-6(US7HG10