實驗動物學課件-lzw

2007-20142014—第一頁1第二頁，共94頁。綱要人類疾病動物模型意義及優(yōu)越性動物模型的設計原則動物模型的分類動物模型的選擇遺傳工程動物模型基因工程改造動物模型建立方法第二頁2第三頁，共94頁。PART

I

人類疾病動物模型第三頁3第四頁，共94頁。概念意義優(yōu)越性第四頁4第五頁，共94頁。人類疾病動物模型是指醫(yī)學研究中建立的具有人類疾病表現(xiàn)的動物實驗對象和相關材料。

應用動物模型是現(xiàn)代醫(yī)學認識生命科學客觀規(guī)律的實驗方法和手段。

第五頁5第六頁，共94頁。意義人類疾病動物模型的研究，本質上是比較醫(yī)學的應用科學，研究人員可利用各種動物的生物特征和疾病特點與人類疾病進行比較研究。長期以來人們發(fā)現(xiàn)，選用人作為實驗對象來推動醫(yī)學的發(fā)展是困難的，臨床所積累的經(jīng)驗不僅在時間和空間上存在著局限性，許多實驗在道義上和方法學上還受到種種限制。動物模型克服了這些不足，其在生物學醫(yī)學研究中所起到的獨特作用，正受到越來越多的重視。第六頁6第七頁，共94頁。優(yōu)越性避免了直接人體實驗造成的危害

臨床上直接研究外傷、中毒、腫瘤病因等研究是有困難的。動物可以作為人類的替代者，在人為設計的條件下反復觀察和研究。

可以克服倫理和社會道德的限制，允許采用某些不能應用于人類的方法途徑，可以方便的獲取樣品。第七頁7第八頁，共94頁。優(yōu)越性2.臨床上平時不易見到的疾病可用動物復制出來

臨床上一些疾病不常見,如放射病、毒氣中毒、烈性傳染病、外傷、腫瘤等，可以采用實驗性誘發(fā)的方法在動物身上復制出來。第八頁8第九頁，共94頁。優(yōu)越性3.可提供發(fā)病率低，潛伏期和病程長的疾病的動物模型

臨床上還有一些如遺傳性、免疫性、代謝性和內分泌、血液等疾病，發(fā)生發(fā)展緩慢、潛伏期長，病程也長，可能幾年或幾十年,在人體很難進行3世代以上的連續(xù)觀察。人們可有意選用動物種群中發(fā)病率高的動物，通過不同手段復制出各種模型，在人為設計的實驗條件下反復觀察和研究，甚至可進行幾十世代的觀察，同時也避免了人體實驗造成的傷害。第九頁9第十頁，共94頁。優(yōu)越性4.可以嚴格控制實驗條件，增強實驗材料的可比性

一般疾病多為零散發(fā)生,在同一時期內,很難獲得一定數(shù)量的定性材料,而模型動物不僅在群體數(shù)量上容易得到滿足，而且可以在方法學上嚴格控制實驗條件，在對飼養(yǎng)條件及遺傳、微生物、營養(yǎng)等因素嚴格控制的情況下，通過物理、化學或生物因素的作用，限制實驗的可變因子，并排除研究過程中其它因素的影響，取得條件一致的、數(shù)量較大的模型材料，從而提高實驗結果的可比性和重復性，使所得到的成果更準確更深入。第十頁10第十一頁，共94頁。優(yōu)越性5.可以簡化實驗操作，便于樣品收集

動物模型作為人類疾病的“復制品”,可按研究者的需要隨時采集各種樣品或分批處死動物收集標本，以了解疾病全過程，這是臨床難以辦到的。

實驗動物向小型化的發(fā)展趨勢更有利于實驗者的日常管理和實驗操作。第十一頁11第十二頁，共94頁。優(yōu)越性6.有助于更全面地認識疾病的本質

在臨床上研究疾病的本質難免帶有一定局限性。許多病原體除人以外也能引起多種動物的感染，其癥狀體征表現(xiàn)可能不完全相同。但是通過對人畜共患病的比較，則可以充分認識同一病原體給不同機體帶來的各種危害，使研究工作上升到立體的水平來揭示某種疾病的本質。

動物模型能夠細致觀察環(huán)境或遺傳因素對疾病發(fā)生發(fā)展的影響，可以全面地認識疾病的本質。第十二頁12第十三頁，共94頁?？偨Y因此，一個好的疾病模型應具有以下特點：再現(xiàn)性好，應再現(xiàn)所要研究的人類疾病，動物疾病表現(xiàn)應與人類疾病相似。動物背景資料完整，生命周期滿足實驗需要。復制率高。專一性好，即一種方法只能復制出一種模型。應該指出，任何一種動物模型都不能全部復制出人類疾病的所有表現(xiàn)，動物畢竟不是人體，模型實驗只是一種間接性研究，只可能在一個局部或一個方面與人類疾病相似。所以，模型實驗結論的正確性是相對的，最終還必須在人體上得到驗證。復制過程中一旦發(fā)現(xiàn)與人類疾病不同的現(xiàn)象，必須分析差異的性質和程度，找出異同點，以正確評估。第十三頁13第十四頁，共94頁。2.設計原則相似性重復性可靠性適用性和可控性易行性和經(jīng)濟性？第十四頁14第十五頁，共94頁。相似性

能夠找到與人類疾病相同的動物自發(fā)性疾病當然最好。例如日本人找到的大白鼠原發(fā)性高血壓(SHR大鼠)就是研究人類原發(fā)性高血壓的理想模型，小型豬自發(fā)性冠狀動脈粥樣硬化是研究人類冠心病的理想模型；自發(fā)性狗類風濕性關節(jié)炎與人類幼年型類風濕性關節(jié)炎十分相似，也是一種理想模型，等等。

與人類完全相同的動物自發(fā)性疾病模型畢竟不可多得，往往需要人工加以復制。為了盡量做到與人類疾病相似，首先要注意動物的選擇。其次，為了盡可能做到模型與人類相似，還要在實踐中對方法不斷加以改進。

如果動物模型與臨床情況不相似，在動物身上有效治療方案就不一定能用于臨床，反之亦然。第十五頁15第十六頁，共94頁。重復性

理想的人類疾病動物模型應該是可重復的，應是可標準化的，不能重復的動物模型是無法進行應用研究的。

為了增強動物模型復制時的重復性，必須在動物品種、品系、年齡、性別、體重、健康情況、飼養(yǎng)管理；實驗及環(huán)境條件，季節(jié)、晝夜節(jié)律、應激、室溫、濕度、氣壓、消毒滅菌；實驗方法步驟；藥品生產(chǎn)廠家、批號、純度規(guī)格、給藥劑型、劑量、途徑、方法；麻醉、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛等用藥情況；儀器型號、靈敏度、精確度；實驗者操作技術熟練程度等等方面保持一致，因為一致性是重復性的可靠保證。第十六頁16第十七頁，共94頁?？煽啃?/p>

復制的動物模型應力求可靠的反映人類疾病，即可特異地可靠地反映該種疾病或某種機能、代謝、結構變化。同時應具備該種疾病的主要癥狀和體征，并經(jīng)受一系列檢測(如心電圖、臨床生理、生化指標檢驗、病理切片等)加以證實。若易自發(fā)地出現(xiàn)某些相應病變的動物，就不應加以選用，易產(chǎn)生與復制疾病相混淆的疾病者也不宜選用。

如：大鼠易患進行性腎病，容易與鉛中毒所致的腎病相混淆，不適合復制鉛中毒模型。蒙古沙鼠較為適合。第十七頁17第十八頁，共94頁。適用性和可控性

設計復制人類疾病動物模型，應盡量考慮在今后臨床能應和便于控制其疾病的發(fā)展，以便于開展研究工作。如：雌激素能中止大小鼠的妊娠，不能中止人的妊娠。含有雌激素活性的避孕藥無法使用大小鼠篩選。

有些動物對致病因子特別敏感，易死亡，不好控制不適宜復制動物模型。如犬腹腔注射糞便濾液而引起腹膜炎，犬可很快大量死亡，來不及觀察和治療。第十八頁18第十九頁，共94頁。易行性和經(jīng)濟性

復制動物模型設計，應盡量做到方法容易執(zhí)行和合乎經(jīng)濟原則。

小動物如大小鼠、地鼠、豚鼠等也可以復制出十分近似的人類疾病模型。它們容易做到遺傳背景明確，體內微生物可加控制，模型性狀顯著且穩(wěn)定，年齡、性別、體重等可任意選擇，而且價廉易得、便于飼養(yǎng)管理，因此可盡量采用。

除非不得已或一些特殊疾病（如痢疾、脊髓灰白質炎等）研究需要外，盡量不用靈長類動物。除了在動物選擇上要考慮易行性和經(jīng)濟性原則外，在模型復制的方法上、指標的觀察上也都要注意這一原則。第十九頁19第二十頁，共94頁。3.動物模型的分類按產(chǎn)生原因分類：1、誘發(fā)性動物模型2、自發(fā)性動物模型3、抗疾病型動物模型4、生物醫(yī)學動物模型第二十頁20第二十一頁，共94頁。誘發(fā)性動物模型

又稱為實驗性動物模型，是指研究者通過使用物理的、化學的、生物的或復合的致病因素作用于動物，造成動物組織、器官或全身一定的損害，出現(xiàn)某些類似人類疾病時的功能、代謝或形態(tài)結構方面的病變。第二十一頁21第二十二頁，共94頁。優(yōu)缺點誘發(fā)性疾病動物模型具有能在短時間內復制出大量疾病模型，并能嚴格控制各種條件使復制出的疾病模型適合研究目的需要等特點，因而為近代醫(yī)學研究所常用，特別是藥物篩選研究工作所首選。但誘發(fā)模型和自然產(chǎn)生的疾病模型在某些方面畢竟存在一定差異。因此在設計誘發(fā)性動物模型要盡量克服其不足，發(fā)揮其特點。第二十二頁22第二十三頁，共94頁。誘發(fā)因素物理因素：機械損傷、放射線損傷、氣壓、手術化學因素：化學藥致癌、化學毒物中毒、強酸強堿燒傷、某種有機成分的增加或減少導致營養(yǎng)性疾病等。生物因素：細菌、病毒、寄生蟲、生物毒素等。復合因素：應用單一因素誘發(fā)難以達到實驗的要求時第二十三頁23第二十四頁，共94頁。應用實例HighFatDietinducedObesity第二十四頁24第二十五頁，共94頁。第二十五頁25第二十六頁，共94頁。第二十六頁26第二十七頁，共94頁。Bone

marrow

transplantation第二十七頁27第二十八頁，共94頁。自發(fā)性動物模型

指實驗動物未經(jīng)任何人工處置，在自然條件下動物自發(fā)產(chǎn)生，或由于基因突變的異常表現(xiàn)通過遺傳育種保留下來的動物模型。

利用這類動物疾病模型來研究人類疾病的最大優(yōu)點，就是疾病的發(fā)生、發(fā)展與人類相應的疾病很相似，均是在自然條件下發(fā)生的疾病，其應用價值就很高。如自發(fā)性高血壓大鼠、中國地鼠的自發(fā)性糖尿病、肥胖癥小鼠等。第二十八頁28第二十九頁，共94頁。應用實例第二十九頁29第三十頁，共94頁?？辜膊⌒蛣游锬Ｐ?/p>

是指特定的疾病不會在某種動物身上發(fā)生，從而可以用來探討為何這種動物對該疾病有天然的抵抗力。如哺乳動物均易感染血吸蟲病，但居住于洞庭湖流域的東方田鼠卻不能復制血吸蟲病。生物醫(yī)學動物模型

是指利用健康動物生物學特征來提供人類疾病相似表現(xiàn)的疾病模型。如：沙鼠缺乏完整的基底動脈環(huán)，是研究中風的理想動物；兔胸腔的特殊結構第三十頁30第三十一頁，共94頁。按系統(tǒng)范圍分類：1、疾病的基本病理過程動物模型2、各系統(tǒng)疾病動物模型第三十一頁31第三十二頁，共94頁。疾病的基本病理過程動物模型是指各種疾病共同性的一些病理變化過程模型。疾病的基本病理過程：致病因素在一定條件下作用于動物，使動物組織、器官或全身造成一定病理損傷，出現(xiàn)各種功能、代謝和形成結構的變化，其中有些變化是各種疾病都可能發(fā)生的，不是某種疾病所特有的一些變化，如發(fā)熱、缺氧、水腫、炎癥、休克、彌漫性血管內凝血、電解質紊亂、酸堿平衡障礙等。第三十二頁32第三十三頁，共94頁。各系統(tǒng)疾病動物模型是指與人類各系統(tǒng)疾病相應的人類疾病動物模型。如心血管、呼吸、消化、造血、泌尿、生殖、內分泌、神經(jīng)、運動等系統(tǒng)疾病模型，還包括各種傳染病、寄生蟲病、地方病、維生素缺乏病、物理損傷性疾病、職業(yè)病和化學中毒性疾病的動物模型。第三十三頁33第三十四頁，共94頁。按模型種類分類：疾病模型的種類包括整體動物、離體器官和組織、細胞株等。整體動物模型是常用的疾病模型之一，也是研究人類疾病的常用手段。第三十四頁34第三十五頁，共94頁。按中醫(yī)藥體系分類

根據(jù)中醫(yī)證分類，動物模型可分為陰虛、陽虛動物模型、氣虛動物模型、血虛動物模型、脾虛和腎虛動物模型、厥脫證動物模型等。

按中藥理論分類，人類疾病動物模型包括解表藥動物模型，清熱藥、瀉下藥、祛風濕藥、利水滲濕、溫里藥、止血藥、止咳藥、化痰藥、平喘藥、安神藥、平肝息風藥、補益藥、理氣藥、活血化瘀藥等動物模型。第三十五頁35第三十六頁，共94頁。4.動物模型的選擇物種遺傳背景品系性別年齡動物級別第三十六頁36第三十七頁，共94頁。動物模型的選擇:物種常見的模式動物線蟲果蠅斑馬魚小鼠第三十七頁37第三十八頁，共94頁。線蟲

線蟲模型對基礎和應用生物學產(chǎn)生了巨大的推動作用,并直接導致了細胞凋亡現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)。第三十八頁38第三十九頁，共94頁。果蠅

雙翅目昆蟲，生活史短，易飼養(yǎng)，繁殖快，染色體少，突變型多，個體小，是一種很好的遺傳學實驗材料。第三十九頁39第四十頁，共94頁。斑馬魚

斑馬魚產(chǎn)卵量多、繁殖迅速、胚胎通體透明,是進行胚胎發(fā)育機理和基因組研究的好材料。第四十頁40第四十一頁，共94頁。小鼠Mouse

Genome

ProjectKOMP&EUCOMMIMPC

小鼠是由小家鼠演變而來。它廣泛分布于世界各地，經(jīng)長期人工飼養(yǎng)選擇培育，已育成1000多近交系和獨立的遠交群。早在17世紀就有人用小鼠做實驗，現(xiàn)已成為使用量最大、研究最詳盡的哺乳類實驗動物。第四十一頁41第四十二頁，共94頁。動物模型的選擇:遺傳背景近交系遠交系F1雜交系第四十二頁42第四十三頁，共94頁。近交系近交系：經(jīng)至少連續(xù)20代的全同胞兄妹交配培育而成，品系內所有個體都可追溯到起源于第20代或以后代數(shù)的一對共同祖先。經(jīng)連續(xù)20代以上親代與子代交配與全同胞兄妹交配有等同效果?；蚋叨纫恢?，表型相近第四十三頁43第四十四頁，共94頁。常見近交系C57BL/6JBALB/cJ129第四十四頁44第四十五頁，共94頁。遠交系(封閉群）以非近親交配方式進行繁殖生產(chǎn)的一個實驗動物種群，在不從其外部引入新個體的條件下，至少連續(xù)繁殖4代以上，封閉群亦稱遠交群?；蚪M成復雜。第四十五頁45第四十六頁，共94頁。常見遠交系ICR小鼠KM小鼠Wistar大鼠第四十六頁46第四十七頁，共94頁。雜交系雜交系:兩個不同近交系交配后生產(chǎn)的第一代優(yōu)點:基因型和表型一致;雜交優(yōu)勢;可以接受來自雙親品系的器官移植缺點:不能自我維持品系延續(xù)F1雜交系命名：B6CBF1

♀♂第四十七頁47第四十八頁，共94頁。非模式動物第四十八頁48第四十九頁，共94頁。動物模型的選擇:品系近交系品系不同，表型不同第四十九頁49第五十頁，共94頁。第五十頁50第五十一頁，共94頁。動物模型的選擇:性別不同性別的動物對同一藥物的敏感程度是有差異的，對各種刺激的反應也不一致，雌性動物性周期不同階段和懷孕、授乳時的機體反應性有較大的改變。有人分析149種毒物對不同性別大小鼠的毒性，發(fā)現(xiàn)雌性的敏感性稍大于雄性。如實驗無特殊要求應選擇雌雄各半做實驗，以避免因性別差異所造成的結果誤差?！帷佟獾谖迨豁?1第五十二頁，共94頁。動物模型的選擇:年齡年齡是重要的生物量，動物的解剖生理特征和反應性隨年齡增加而發(fā)生明顯的變化。一般幼年動物比成年動物敏感。老年動物的代謝功能低下，反應不靈敏，一般不選用。對毒物反應的年齡差異，可能與解毒酶活性有關。人類胎兒時期缺乏這些酶，對毒物敏感，新生兒8周內達到成人水平。實驗動物年齡與體重一般成正相關，大小鼠可根據(jù)體重推算年齡。體重和飼養(yǎng)管理密切相關。第五十二頁52第五十三頁，共94頁。動物模型的選擇:動物級別普通級Conventional

Animal(CV)不攜帶所規(guī)定的人畜共患病病原和動物烈性傳染病的病原。清潔級Clean

Animal(CL)除普通動物應排除的病原外，不攜帶對動物危害大和對科學研究干擾大的病原。無特定病原體動物Specific

Pathogen

Free

Animal(SPF)是指機體內無特定的微生物和寄生蟲存在的動物。無菌動物Germ

Free

Animal(GF)無可檢出的一切生命體。第五十三頁53第五十四頁，共94頁。病毒檢測項目動物等級病

毒小鼠無菌動物無特定病原體動物清潔動物淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒LymphocyticChoriomeningitisVirus(LCMV)漢坦病毒Hantavirus(HV)鼠痘病毒EctromeliaVirus(Ect.)小鼠肝炎病毒MouseHepatitisVirus(MHV)仙臺病毒SendaiVirus(SV)○○●●●小鼠肺炎病毒PneumoniaVirusofMice(PVM)呼腸孤病毒Ⅲ型ReovirustypeⅢ(Reo-3)小鼠細小病毒MinuteVirusofMice(MVM)小鼠腦脊髓炎病毒Theiler'sMouseEncephalomyelitisVirus(TMEV)小鼠腺病毒MouseAdenovirus(Mad)多瘤病毒PolyomaVirus(POLY)●●●○○○無任何可查到的病毒●注：●必須檢測項目，要求陰性；○必要時檢查項目，要求陰性。第五十四頁54第五十五頁，共94頁。病原菌檢測項目動物等級病

原

菌小鼠無菌動物無特定病原體動物清潔動物沙門菌Salmonellaspp單核細胞增生性李斯特桿菌Listeriamonocytogenes假結核耶爾森菌Yersiniapseudotuberculosis小腸結腸炎耶爾森菌Yesiniaenterocolitica皮膚病原真菌Pathogenicdermalfungi念珠狀鏈桿菌Streptobacillusmoniliformis支氣管鮑特桿菌Bordetellabronchiseptica支原體Mycoplasmaspp鼠棒狀桿菌Corynebacteriumkutscheri泰澤病原體Tyzzer'sorganism大腸埃希菌O115a,C,K(B)EscherichiacoliO115a,C,K(B)●○○○○○○●●●○嗜肺巴斯德桿菌Pasteurellapneumotropica肺炎克雷伯桿菌Klebsiellapneumoniae金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus肺炎鏈球菌Streptococcuspnemoniae乙型溶血性鏈球菌β-hemolyticstreptococcus綠膿桿菌Pseudomonasaeruginosa●●●○○●無任何可查到的細菌●注：●必須檢測項目，要求陰性；○必要時檢查項目，要求陰性。第五十五頁55第五十六頁，共94頁。寄生蟲檢測項目動物等級寄

生

蟲小鼠無菌動物無特定病原體動物清潔動物體外寄生蟲（節(jié)肢動物）Ectoparasites弓形蟲

Toxoplasmagondii兔腦原蟲Encephalitozooncuniculi卡氏肺孢子蟲Pneumocystiscarinii全部蠕蟲AllHelminths●●○○●鞭毛蟲Flagellates纖毛蟲Ciliates●●無任何可查到的寄生蟲●注：●必須檢測項目，要求陰性；○必要時檢查項目，要求陰性。第五十六頁56第五十七頁，共94頁。屏障環(huán)境指標（SPF級以上）項目指標溫度，℃20-26相對濕度，％40～70換氣次數(shù)，次/h10～20*氣流速度，m/s0.1～0.2壓強梯度，Pa20～50**空氣潔凈度，級10000落下菌數(shù)，個/皿≤3氨濃度，mg/m3≤14噪聲，dB≤60照度，lx工作照度150～300動物照度15～20晝夜明暗交替時間，h12/12第五十七頁57第五十八頁，共94頁?？偨Y：動物模型的選擇實驗目的第五十八頁58第五十九頁，共94頁。PART

II

遺傳工程動物模型第五十九頁59第六十頁，共94頁?；蚬こ谈脑燹D基因（Transgene）基因敲除（Knockout）全敲（Conventional

Knockout）條件性基因敲除（Conditional

knockout）基因敲入（Knockin）CRISPR/Cas9誘導性調控（Inducible）第六十頁60第六十一頁，共94頁。1.轉基因過表達外源基因隨機插入表達量與插入位點，插入量相關第六十一頁61第六十二頁，共94頁。轉基因原件PromoterCDSpolyAIRESeGFP，tdTomato，YFPlacZtTA/rtTA第六十二頁62第六十三頁，共94頁。2.基因敲除第六十三頁63第六十四頁，共94頁。EmbryonicStemCells(ESCells)來源：囊胚內細胞團全能性未分化狀態(tài)Germline

Transmission

Potential第六十四頁64第六十五頁，共94頁。ESCellLines改造后適合基因打靶的ES細胞系穩(wěn)定性多能性Germline傳遞效率高背景，遺傳信息清晰第六十五頁65第六十六頁，共94頁。同源重組第六十六頁66第六十七頁，共94頁。Holliday

Junction第六十七頁67第六十八頁，共94頁。ConventionalKnockout第六十八頁68第六十九頁，共94頁。Conditional

Knockout:

Cre-loxpsystemCrerecombinaseisa38-KDproteinencodedbybacteriophageP1MostwidelyusedloxsiteisloxpfrombacteriophageP1SitedirectedrecombinationFlpe/FRTsystemfromYeast第六十九頁69第七十頁，共94頁。刪除(Excision)第七十頁70第七十一頁，共94頁。倒位(Invention)第七十一頁71第七十二頁，共94頁。片段互換(Exc