第一章基因工程緒論

基因工程GeneEngineering任課教師：恩特馬克博士教授E-mail：etmkb@授課內(nèi)容（48學(xué)時(shí)）第一章基因工程概論第二章基因工程常用技術(shù)第三章基因工程工具酶及其應(yīng)用第四章基因工程載體第五章目的基因的制備第六章受體細(xì)胞和重組基因的導(dǎo)入

第七章外源基因的高效表達(dá)第八章基因工程的應(yīng)用教材

基因工程孫明主編高等教育出版社主要參考教材1.基因工程

樓士林主編科學(xué)出版社2.基因工程原理課件

張義正四川大學(xué)生科院3.基因工程吳乃虎主編科學(xué)出版社4.克隆技術(shù)李建凡主編化學(xué)工業(yè)出版社第一章基因工程概況一、前言基因工程是生物技術(shù)的核心和關(guān)鍵，是主導(dǎo)技術(shù)細(xì)胞工程是生物技術(shù)的基礎(chǔ)酶工程是生物技術(shù)的條件發(fā)酵工程是生物技術(shù)獲得最終產(chǎn)品的手段生物技術(shù)是一個(gè)綜合技術(shù)體系，其中基因工程和細(xì)胞融合技術(shù)最為突出。（一）基因工程的含義基因工程：

在體外將目的基因片段插入載體DNA上，構(gòu)建重組DNA（基因的新組合),將其導(dǎo)入原先沒有這類基因的受體細(xì)胞內(nèi)，而能持續(xù)穩(wěn)定的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯的過程。基因工程優(yōu)點(diǎn)：

打破了常規(guī)育種難以突破的物種界限，可以使原核生物與真核生物之間、動(dòng)物與植物之間、甚至人與其他生物之間的遺傳信息進(jìn)行重組和轉(zhuǎn)移。基因工程的核心內(nèi)容是基因克隆和基因表達(dá)（二）基因工程理論依據(jù)1.不同的基因具有相同的物質(zhì)基礎(chǔ)：

1944年肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實(shí)；1952年噬菌體侵染實(shí)驗(yàn)；煙草花葉病毒侵染實(shí)驗(yàn)2.基因是可切割的:1970年在分離并純化的核酸內(nèi)切酶HindII

3.基因是可轉(zhuǎn)移的:1951年跳躍基因的發(fā)現(xiàn)4.多肽與基因之間存在對(duì)應(yīng)關(guān)系:1958年中心法則的提出

5.遺傳密碼通用性:1966年破譯了全部64個(gè)遺傳密碼6.基因中的遺傳信息是可傳遞的:

1958年同位素示蹤實(shí)驗(yàn)，DNA半保留復(fù)制理論BacteriumRadioactiveprotein(35S)RadioactivephageinfectsbacterialcellsBlenderseparatesproteincoatsfrombacterialsurfaceCentrifugeandmeasureradioactivityinpelletandsupernatantRadioactivityinsupernatant,butnotpelletHershey&Chase（1952）

HersheyandChase(1952):RadioactiveDNA(32P)Radioactivityinpellet,butnotsupernatantTherefore,itistheviralDNA,andnotprotein,thatprogramscellstomakecopiesofthevirus.（三）基因工程研究的技術(shù)路線基因工程研究的成敗是與技術(shù)路線的嚴(yán)密設(shè)計(jì)直接相關(guān)。確定研究目標(biāo)在國內(nèi)外已發(fā)表研究成果自己提出的技術(shù)路線嚴(yán)密設(shè)計(jì)可行技術(shù)路線

生物材料人工合成cDNA文庫RNAmRNA目的基因基因組文庫DNA克隆載體酶切+重組DNA受體細(xì)胞導(dǎo)入克隆子篩選轉(zhuǎn)基因生物（四）基因工程研究發(fā)展史基因工程是在生物化學(xué)、分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)等學(xué)科的研究成果基礎(chǔ)上逐步發(fā)展起來的?；蚬こ萄芯康陌l(fā)展大致可以分為以下三個(gè)階段。1.基因工程的準(zhǔn)備階段2.基因工程問世3.基因工程迅速發(fā)展階段1.基因工程的準(zhǔn)備階段Averyetal.(1944)demonstratedthattheDNAisthegeneticmaterialbyusingthetransformationtest.A:Capsulatedstrain;B:Non-capsulatedstrain.2003年，恩特馬克等構(gòu)建的多殺性巴氏桿菌有莢膜菌株和無莢膜突變株WatsonandCrick(1952)–DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型DNAmRNAProteintranscriptiontranslation

它們?cè)?958-1971年先后建立了“中心法則”，揭示了遺傳信息的流向和表達(dá)問題。1966年破譯了全部64個(gè)遺傳密碼以上研究成果為基因工程的問世提供了理論依據(jù)。DNA分子的體外切割與連接技術(shù)1967年世界上5個(gè)實(shí)驗(yàn)室同時(shí)發(fā)現(xiàn)DNA連接酶；1970年SmithandWilox在流感嗜血桿菌中分離純化了限制性內(nèi)切酶HindII；1972年Boyer發(fā)現(xiàn)了限制性內(nèi)切酶EcoRI?；蚬こ梯d體：

病毒、質(zhì)粒、噬菌體及大腸桿菌的應(yīng)用。1972年在美國斯坦福大學(xué)的P.Berg

博士領(lǐng)導(dǎo)的研究小組，完成了世界上第一次成功的DNA體外重組實(shí)驗(yàn)。將SV40和λ噬菌體DNA片斷連接起來。2.基因工程的問世1973年CohenandBoyer等人合作，把非洲爪蟾核糖體蛋白基因片段與pSC101質(zhì)粒DNA片段重組后導(dǎo)入大腸桿菌，證明動(dòng)物基因也能進(jìn)入大腸桿菌細(xì)胞并轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的mRNA分子。以上研究表明：（1）pSC101質(zhì)粒DNA可以作為基因克隆的載體，從而把外源DNA導(dǎo)入寄主細(xì)胞；（2）像非洲爪蟾這樣的高等生物的基因也可以被成功地轉(zhuǎn)移到原核細(xì)胞中并實(shí)現(xiàn)其功能表達(dá)；（3）質(zhì)粒DNA-大腸桿菌細(xì)胞作為一種成功的基因克隆體系，有可能在重組DNA或基因工程研究中發(fā)揮重要作用。

此研究成果表明基因工程已正式問世。3.基因工程的迅速發(fā)展階段從基因工程問世以來的這38年是基因工程迅速發(fā)展的階段。主要表現(xiàn)：

新的基因工程操作技術(shù)構(gòu)建了原核生物載體和真核生物載體獲得大量轉(zhuǎn)基因菌株1980年首次通過顯微注射培養(yǎng)出世界上第一個(gè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（transgenicmouse）。1983年采用膿桿菌介導(dǎo)法培育出世界上第一例轉(zhuǎn)基因植物-轉(zhuǎn)基因煙草，至1998年轉(zhuǎn)基因植物數(shù)有4387項(xiàng)。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物：轉(zhuǎn)生長激素基因魚、轉(zhuǎn)生長激素基因豬和抗豬瘟病轉(zhuǎn)基因豬等。用基因工程技術(shù)研制生產(chǎn)的貴重藥物已市場的約有100多種。凝血因子VIIIXVIII細(xì)胞刺激因子SCFTPOG-CSF,M-CSF,EPO生長因子骨形成因子肌營養(yǎng)因子FGF，GM-CSF

胰島素類似物血小板衍生因子HGHEGF干擾素IFN,α1b,α1b,α2a,αn3,β,β1b,γ,γ1b白介素1α,1β3,6,2,4,1211激素人促卵泡素甲狀旁腺素胰高血糖素胰島素，心鈉素降鈣素促黃體生成素IGF-1

甲狀腺刺激素酶羧肽酶尿酸氧化酶葡萄腦苷酯酶脫氧核糖核酸酶鏈激酶疫苗CEAHSV,流感病毒LymeHBV，HCV其他水蛭素松弛素,HB,SODTNF，tPA，白蛋白,殺菌蛋白單克隆抗體可溶性補(bǔ)體受體I型國內(nèi)產(chǎn)業(yè)化生物藥品概況產(chǎn)品種類臨床I臨床II臨床III批準(zhǔn)上市二、基因工程研究內(nèi)容（一）基礎(chǔ)研究進(jìn)行基因工程研究的四個(gè)必要條件：工具酶、基因、載體、受體細(xì)胞。1.基因工程克隆載體的研究：基因工程的發(fā)展是與克隆載體構(gòu)建密切相關(guān)的，由于最早構(gòu)建的克隆載體是原核生物的克隆載體，所以原核生物的基因工程研究得以發(fā)展；Ti質(zhì)粒的發(fā)現(xiàn)使植物基因工程研究迅速發(fā)展起來；動(dòng)物病毒克隆載體的構(gòu)建，使動(dòng)物基因工程研究也有一定的進(jìn)展?？梢哉J(rèn)為構(gòu)建克隆載體是基因工程技術(shù)路線中的核心環(huán)節(jié)。2.基因工程受體系統(tǒng)的研究基因工程的受體細(xì)胞與載體是一個(gè)系統(tǒng)的兩個(gè)方面。受體是克隆載體的宿主，是外源目的基因復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯的場所。受體：單細(xì)胞、組織、器官和個(gè)體均可以作為受體。原核生物受體：E.coli真核生物受體:酵母是單細(xì)胞真核生物受體植物受體：愈傷組織、細(xì)胞和原生質(zhì)，部分組織和器官動(dòng)物受體：生殖細(xì)胞和早期胚胎細(xì)胞作為基因工程受體；