基因工程的基本操作過(guò)程

1.2基因工程的基本操作程序

基因工程的基本操作程序目的基因的獲取基因表達(dá)載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞練習(xí)目的基因的檢測(cè)與鑒定

目的基因主要是指______________________編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因目的基因的獲取供體生物細(xì)胞取出DNA用限制酶剪去多余部分目的基因即：將需要的基因從供體生物細(xì)胞內(nèi)提取出來(lái)目前被廣泛提取使用的目的基因有：蘇云金桿菌抗蟲(chóng)基因、植物抗病基因（抗病毒、抗細(xì)菌)、人胰島素基因等。獲得目的基因的方法

1）從基因文庫(kù)中獲取目的基因1.什么是基因文庫(kù)？（p9）2.怎樣從基因文庫(kù)中得到我們所需的目的基因？種類：基因組文庫(kù)：部分基因文庫(kù)(cDNA文庫(kù))：2）2）人工合成3）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因含有一種生物的全部基因含有一種生物的部分基因根據(jù)基因的有關(guān)信息：如基因表達(dá)的產(chǎn)物等。（p9）1.用一定的_________切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切口，露出____________。2.用_____________切斷目的基因，使其產(chǎn)生_________________?！?/p>

核心3.將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的______處，再加入適量___________，形成了一個(gè)重組

DNA分子（重組質(zhì)粒）限制酶黏性末端同一種限制酶的黏性末端切口DNA連接酶相同(二)基因表達(dá)載體的構(gòu)建基因表達(dá)載體的構(gòu)建——核心質(zhì)粒DNA分子一個(gè)切口兩個(gè)黏性末端兩個(gè)切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種限制酶

目的基因與運(yùn)載體的結(jié)合過(guò)程，實(shí)際上是不同來(lái)源的基因重組的過(guò)程。

科學(xué)家在培育抗蟲(chóng)棉時(shí)，經(jīng)過(guò)了許多復(fù)雜的過(guò)程和不懈的努力，才獲得成功。起初把蘇云金芽孢桿菌的抗蟲(chóng)基因插入載體質(zhì)粒中，然后導(dǎo)入棉花的受精卵中，結(jié)果抗蟲(chóng)基因在棉花體內(nèi)沒(méi)有表達(dá)。然后在插入抗蟲(chóng)基因的質(zhì)粒中插入啟動(dòng)子(抗蟲(chóng)基因首端)，導(dǎo)入棉花受精卵，長(zhǎng)成的棉花植株還是沒(méi)有抗蟲(chóng)能力。科學(xué)家又在有啟動(dòng)子、抗蟲(chóng)基因的質(zhì)粒中插入終止子(抗蟲(chóng)基因末端)，導(dǎo)入棉花受精卵，結(jié)果成長(zhǎng)的植株，有了抗蟲(chóng)能力。資料:基因表達(dá)載體的組成：目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。a、目的基因b、啟動(dòng)子c、終止子d、標(biāo)記基因(三)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞常用的受體細(xì)胞：動(dòng)植物細(xì)胞、大腸桿菌、土壤農(nóng)桿菌、枯草桿菌等。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的原理：借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑。轉(zhuǎn)化——目的基因進(jìn)入_________內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持_____和_____的過(guò)程受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)方法導(dǎo)入植物細(xì)胞導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞導(dǎo)入微生物細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——

感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子(三)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞(四)目的基因的檢測(cè)與鑒定——檢查是否成功分子檢測(cè)個(gè)體鑒定：①檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA

上是否插入了目的基因②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA③檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲(chóng)鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方法——方法——方法——DNA分子雜交分子雜交抗原-抗體雜交PCR技術(shù)—聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

原理：前提：條件：PCR擴(kuò)增儀DNA雙鏈復(fù)制的基本原理一段已知目的基因的核苷酸序列四種脫氧核苷酸一對(duì)引物熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Taq酶）DNA的兩條鏈為模板溫度控制和緩沖液前提：一段已知目的基因的核苷酸序列，根據(jù)這一序列合成引物。引物：一小段單鏈DNA或RNA，一般20～30個(gè)堿基，能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)。PCR擴(kuò)增時(shí)為什么需要引物呢？類別項(xiàng)目

復(fù)制

轉(zhuǎn)錄場(chǎng)所特點(diǎn)模板原料酶能量堿基配對(duì)產(chǎn)物細(xì)胞核只有DNA的一條鏈四種核糖核苷酸RNA聚合酶ATPA-UC-GT-AG-C細(xì)胞核DNA的兩條鏈四種脫氧核苷酸解旋酶、DNA聚合酶ATPA-TC-GT-AG-C兩個(gè)雙鏈DNA分子一條單鏈mRNA邊解旋邊復(fù)制，半保留復(fù)制邊解旋邊轉(zhuǎn)錄5/3/G—GT—C3/5/G—AC—C5/3/引物ⅡG—G變性復(fù)性延伸1.目的基因DNA受熱變性，解鏈；2.引物與單鏈互補(bǔ)結(jié)合；3.合成鏈在DNA聚合酶作用下進(jìn)行延伸。5/3/A—G引物Ⅰ利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因PCR技術(shù)中引物的作用PCR的意思是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種擴(kuò)增DNA的技術(shù)（就是復(fù)制DNA）DNA復(fù)制其實(shí)很復(fù)雜，DNA聚合酶有一種特性，他只能把脫氧核糖核酸接到一段現(xiàn)有的DNA或RNA上。第一個(gè)位置上的脫氧核糖核酸沒(méi)辦法弄到了。在人體內(nèi)這個(gè)部分是由RNA聚合酶完成的，先由這個(gè)酶在基因的第一段復(fù)制出一小段RNA，然后再由DNA聚合酶在后面添上以后的DNA。這段RNA就叫RNA引物。等都填完后再由引物酶把這段RNA切掉換成DNA。

PCR中可以用已經(jīng)合成的DNA引物來(lái)代替RNA引物，這些就是引物的作用PCR技術(shù)擴(kuò)增過(guò)程a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，

斷裂，形成_______

b、復(fù)性（55℃-60℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補(bǔ)的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈目的基因的mRNA單鏈DNA(cDNA）雙鏈DNA(即目的基因)反轉(zhuǎn)錄合成1）反轉(zhuǎn)錄法：

以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列目的基因推測(cè)推測(cè)化學(xué)合成2）根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法：2.微生物作受體細(xì)胞原因：將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞3.轉(zhuǎn)化方法：大腸桿菌繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)少

處理細(xì)胞→

細(xì)胞→表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合→_________細(xì)胞吸收DNA分子。Ca2+感受態(tài)感受態(tài)1.常用菌：

目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA上農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物細(xì)胞整合到受體細(xì)胞的染色體上目的基因的遺傳特性得以維持穩(wěn)定和表達(dá)1.農(nóng)桿菌特點(diǎn)：易感染雙子葉植物和裸子植物。Ti質(zhì)粒的T-DNA可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞的染色體上2.轉(zhuǎn)化如果顯示出雜交帶，就表明待測(cè)樣品含有目的基因或目的基因已經(jīng)轉(zhuǎn)錄。

不能，受體細(xì)胞必須表現(xiàn)出特定的性狀，才能說(shuō)明目的基因完成了表達(dá)。受體細(xì)胞攝入DNA分子后就說(shuō)明目的基因完成了表達(dá)嗎？若不能表達(dá)，要對(duì)抗蟲(chóng)基因再進(jìn)行修飾。

例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲(chóng)，如蟲(chóng)吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說(shuō)明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達(dá)。如蟲(chóng)吃后中毒死亡，則說(shuō)明攝入了抗蟲(chóng)基因并得到表達(dá)。無(wú)表達(dá)產(chǎn)物無(wú)表達(dá)產(chǎn)物有表達(dá)產(chǎn)物無(wú)表達(dá)產(chǎn)物

細(xì)菌的檢測(cè)，將每個(gè)受體細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)形成菌落，檢測(cè)菌落中是否有目的基因的表達(dá)產(chǎn)物。淘汰無(wú)表達(dá)產(chǎn)物的菌落，保留有表達(dá)產(chǎn)物的進(jìn)一步培養(yǎng)、研究?；蛭膸?kù)的構(gòu)建（1）構(gòu)建基因組文庫(kù)將某種生物體內(nèi)的DNA全部提取出來(lái)，選用適當(dāng)?shù)南拗泼?，將DNA切成一定范圍大小的DNA片段，然后將這些片段分別與載體連接起來(lái)，導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存，每個(gè)受體菌都含有了一段不同的DNA片段。這個(gè)群體包含了這種生物的所有基因。供體細(xì)胞中的DNA許多DNA片段載體限制酶分別與載體連接，載入受體菌導(dǎo)入鳥(niǎo)槍法（散彈射擊法）讓供體細(xì)胞提供的所有DNA片段分別在各個(gè)受體菌中大量復(fù)制（即擴(kuò)增），從中找出含有目的基因的細(xì)胞，再利用一定方法將目的基因的DNA片段分離出來(lái)。外源DNA擴(kuò)增產(chǎn)生特定性狀目的基因分離通過(guò)對(duì)受體菌的培養(yǎng)而儲(chǔ)存基因（2）構(gòu)建cDNA文庫(kù)用某種生物發(fā)育的某個(gè)時(shí)期的mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的多種互補(bǔ)DNA（也叫cDNA）片段，與載體連接后儲(chǔ)存在一個(gè)受體菌群中，這個(gè)受體菌群體叫做這種生物cDNA文庫(kù)。1.下表關(guān)于基因工程中有關(guān)基因操作的名詞及對(duì)應(yīng)的內(nèi)容，正確的組合是 2、下列屬于獲取目的基因的方法的是()①利用mRNA反轉(zhuǎn)錄形成②從基因組文庫(kù)中提取③從受體細(xì)胞中提?、芾肞CR技術(shù)⑤利用DNA轉(zhuǎn)錄 ⑥人工合成A.①②③⑤B.①②⑤⑥C.①②③④D.①②④⑥3.細(xì)菌的質(zhì)粒分子帶有一個(gè)抗菌素抗性基因，該抗性基因在基因工程中的主要作用是

A．提高受體細(xì)胞在自然環(huán)境中的耐藥性B．有利于對(duì)目的基因是否導(dǎo)入進(jìn)行檢測(cè)C．增加質(zhì)粒分子的分子量D．便于與外源基因連接4.

有關(guān)基因工程的敘述正確的是A．限制酶只在獲得目的基因時(shí)才用B．重組質(zhì)粒的形成是在細(xì)胞內(nèi)完成的C．質(zhì)粒都可作為運(yùn)載體D．蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供資料5.哪項(xiàng)不是基因表達(dá)載體的組成部分()A.啟動(dòng)子B.終止密碼

C.標(biāo)記基因D.目的基因6.下列