第二章 環(huán)境生物技術(shù)的生物學(xué)基礎(chǔ)

第二章環(huán)境生物技術(shù)生物學(xué)基礎(chǔ)

第一節(jié)酶工程酶工程：是利用酶的催化作用進(jìn)行物質(zhì)轉(zhuǎn)化的技術(shù)，是將酶學(xué)理論與化工技術(shù)結(jié)合而形成的新技術(shù)。其主要任務(wù)是：通過(guò)預(yù)先設(shè)計(jì)，經(jīng)過(guò)人工操作控制而獲得大量所需的酶，并通過(guò)各種方法使酶發(fā)揮出最大的催化功能；目的是為我們提供產(chǎn)品或以特定的功能為我們服務(wù)。1、生產(chǎn)、分離純化2、酶分子修飾3、酶的固定化4、酶的應(yīng)用一、酶的生產(chǎn)及分離純化（一）酶的生產(chǎn)1.對(duì)酶源的要求酶含量豐富提取、純化方便2.微生物作為酶的優(yōu)勢(shì)易得到所需的酶類易獲得高產(chǎn)菌株生產(chǎn)成本低微生物生長(zhǎng)周期短生產(chǎn)易管理提高微生物產(chǎn)酶能力的途徑較多可提高酶產(chǎn)量或改造酶3.對(duì)酶生產(chǎn)菌的要求1）不是致病菌，也不產(chǎn)毒素2）不易變異退化，不易感染噬菌體3）產(chǎn)酶量高，而且最好產(chǎn)生胞外酶4）原料廉價(jià)，周期短，易培養(yǎng)（二）酶的分離純化酶的分離提純可分為四個(gè)要點(diǎn)：酶源選材勻漿方法分離步驟結(jié)晶方法酶的分離提純涉及的理論與技術(shù)：酶主要是蛋白質(zhì)酶具有催化功能酶分離提純步驟如下：半勻漿選材提取液粗酶制品精制細(xì)胞器純酶酶結(jié)晶抽取或分散親和分離法少量酶分離方法結(jié)晶法1.酶提取定義：是將酶從生物組織或細(xì)胞中以溶解狀態(tài)釋放出來(lái)的過(guò)程，以供進(jìn)一步從中分離純化出所需的酶。1）組織及細(xì)胞的破碎（1）物理法（包括機(jī)械法）（2）化學(xué)法（3）酶解法2）酶的提取原理———相似相溶常用方法：（1）酸、堿、鹽溶液提?。?）有機(jī)溶液提取2．酶分離純化的沉淀技術(shù)1）鹽析———溶解度的差異鹽溶－低濃度的中性鹽可增加電解質(zhì)類物質(zhì)的溶解度；鹽析－當(dāng)鹽濃度繼續(xù)增加時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度反而降低而析出。（1）基本原理a.減弱了蛋白質(zhì)的水合程度b.中和了蛋白質(zhì)電荷，使靜電荷減少（2）影響因素a.蛋白質(zhì)的濃度b.介質(zhì)的pHc.溫度d.鹽類型2）PEG沉淀法———溶解度的差異（1）基本原理空間排阻學(xué)說(shuō)：PEG分子在溶液中形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，與溶液中的蛋白質(zhì)分子發(fā)生空間排擠作用，從而使蛋白質(zhì)分子凝聚而沉淀下來(lái)。（2）影響因素a.蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量——大，沉降好b.蛋白質(zhì)濃度c.pH值d.離子強(qiáng)度e.溫度f(wàn).PEG聚合度3)有機(jī)溶劑沉淀法——溶解度的差異（1）基本原理a.介質(zhì)的介電常數(shù)下降，增強(qiáng)靜電作用力b.降低水合程度（2）常用方式a.分級(jí)沉淀有用的蛋白質(zhì)b.雜蛋白質(zhì)變性（3）缺點(diǎn)——易使酶變性，低溫操作4）等電點(diǎn)沉淀法——溶解度的差異蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)（ｐI）處，凈電荷為0，易于沉淀。5）熱變性沉淀法——熱穩(wěn)定性的差異

可用其他輔助因子、底物等方法，使目的酶的熱變性溫度提高。3.酶分離純化的層析技術(shù)

層析分離——是利用混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)｛分子的大小和形狀、分子極性、吸附力、分子親和力和分配系數(shù)｝的不同，使各組分的分布程度不同而達(dá)到分離。1）凝膠過(guò)濾層析——分子大小和形狀的差異基本原理酶液中各組分按相對(duì)分子質(zhì)量從大到小的順序先后流出層析柱，從而實(shí)現(xiàn)分離純化。優(yōu)點(diǎn)條件溫和，操作簡(jiǎn)便，分離范圍廣，回收率高，層析柱可反復(fù)使用，無(wú)需再生處理,可分段分離。常用的凝膠交聯(lián)葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠2）離子交換層析——電荷性質(zhì)的差異它利用離子交換劑上可解離基團(tuán)對(duì)各種離子的親和力不同而進(jìn)行分離。（1）基本原理蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，不同蛋白質(zhì)由于其pI不同，在同一種pH值介質(zhì)中電離狀況不同，分子所帶電荷種類和數(shù)量就不同，與離子交換劑的靜電吸附能力也不同。通過(guò)吸附和改變離子強(qiáng)度或pH值解吸洗脫，可使蛋白質(zhì)依據(jù)其靜電吸附能力由弱到強(qiáng)的順序而分離開(kāi)來(lái)。（2）洗脫方法a.梯度洗脫b.階段洗脫3）親和層析——親和力的差異（1）基本原理利用配基與酶結(jié)合能力而將目的酶分離出來(lái)。

（2）載體a.應(yīng)具有均一、堅(jiān)實(shí)、多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)b.親水c.具有可活化和改變的化學(xué)基團(tuán)d.具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性交聯(lián)瓊脂糖凝膠

(3)配基a.配基與酶的親和力b.配基與載體的結(jié)合方式引入手臂可避免配基在載體上密度太大而造成的空間障礙。W-氨烷基化合物4）高效液相色譜（1）基本原理用檢測(cè)器檢出，由收集器收集同一色譜的目的酶。（2）HPLC的優(yōu)點(diǎn)：分辨率高；快速，整個(gè)分離過(guò)程僅幾十分鐘；靈敏度高；一根柱可分析多個(gè)樣品，而無(wú)需重新填裝柱。4.酶分離純化的電泳技術(shù)電泳—帶電物質(zhì)在直流電場(chǎng)作用下，向著與其電荷相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。區(qū)帶電泳——樣品溶液在一惰性支持物上進(jìn)行電泳的過(guò)程。電泳后，不同的蛋白質(zhì)組成被分離形成帶狀區(qū)間。區(qū)帶的位置可用專一蛋白質(zhì)染料染色顯示，有些也可利用伴有顏色變化的酶催化反應(yīng)來(lái)顯示。區(qū)帶電泳的方法很多，在酶分離純化中常用的有：1）聚丙烯酰胺凝膠電泳2）等電聚焦（一）問(wèn)題的提出1、定義———通過(guò)各種方法使酶分子結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的某些特性和功能的過(guò)程。利用的是“結(jié)構(gòu)決定功能”。2、修飾目的1）提高酶活力；2）增強(qiáng)穩(wěn)定性；3）環(huán)境可改變；4）改變最適pH或T；5）改變酶的特異性；6）改變催化類型；7）提高反應(yīng)效率。二、酶分子修飾3.修飾方法1）金屬離子置換修飾；2）大分子結(jié)合修飾；3）肽鏈有限水解修飾；4）酶蛋白側(cè)鏈基團(tuán)修飾；5）氨基酸置換修飾。4.現(xiàn)在進(jìn)行的工作1）設(shè)法使酶的活性結(jié)構(gòu)加固；2）通過(guò)化學(xué)修飾或酶法修飾改變酶的活性；3）設(shè)法消除免疫性或抗原性以利于醫(yī)療應(yīng)用。

1.定義通過(guò)化學(xué)手段將某些化學(xué)物質(zhì)或基團(tuán)結(jié)合到酶分子上，以改變酶的物理化學(xué)性質(zhì)，達(dá)到改變酶的催化性質(zhì)的目的?；瘜W(xué)修飾——是指通過(guò)主鏈的剪接切割和側(cè)鏈的化學(xué)修飾對(duì)酶分子進(jìn)行改造，其目的在于改變酶的一些性質(zhì)，創(chuàng)造出天然酶不具備的某些優(yōu)良性狀，擴(kuò)大酶的應(yīng)用以達(dá)到較高的經(jīng)濟(jì)效益。它主要是利用修飾劑所具有的各類化學(xué)基團(tuán)的特性，直接或經(jīng)一定活化步驟與酶分子的某種氨基酸殘基產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)，從而改造酶的結(jié)構(gòu)和功能。（二）酶分子的化學(xué)修飾2.修飾常用的方法1）部分水解酶的非活性主鏈；2）對(duì)活性部位或非活性部位以外的側(cè)鏈基團(tuán)進(jìn)行共價(jià)修飾；3）輔酶因子的置換。3.常用的修飾劑1）?；噭?；2）烷化劑；3）形成酯和酰胺的試劑；4）氧化還原試劑；5）親電子試劑4.修飾時(shí)的注意事項(xiàng)1）對(duì)修飾劑的要求——分子質(zhì)量大、生物相容性和水溶性好、反應(yīng)基團(tuán)多、半衰期長(zhǎng)；2）對(duì)酶性質(zhì)的了解——活性部位、最適條件、側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)性質(zhì)以及反應(yīng)活性；3）反應(yīng)條件的選擇——酶穩(wěn)定的條件三、酶固定化

（一）概述1.問(wèn)題的提出1）酶的穩(wěn)定性差；2）難回收；3）難分離純化（產(chǎn)物與酶）。2.基本概念

酶的固定化——將酶與水不溶性的載體結(jié)合，制備固定化酶的過(guò)程。

固定化酶——固定在載體上并在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行催化反應(yīng)的酶。固定化酶的原料——純酶、結(jié)合在死細(xì)胞或細(xì)胞碎片的酶或酶系（固定化菌體）1.吸附法——利用各種固體吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面上而使酶固定化的方法常用吸附劑——活性炭、氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅膠、羥基磷灰石。特點(diǎn)——操作簡(jiǎn)單、條件溫和、不會(huì)使酶失活；結(jié)合力弱、易脫落。（二）固定化方法吸附法包埋法結(jié)合法分類2、包埋法——將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中，使酶固定。載體——瓊脂、瓊脂糖、海藻酸鈉等。凝膠包埋法半透膜包埋法分類根據(jù)載體材料和方法1）凝膠包埋法——將酶或含酶菌體包埋在各種凝膠內(nèi)部的微孔中，制成一定形狀的固定化酶或固定化菌體，大多數(shù)為球狀或片狀。

常用凝膠——天然凝膠（瓊脂凝膠、角叉菜膠、明膠等）和合成凝膠（聚丙烯酰膠凝膠、光交聯(lián)樹(shù)脂）2）半透膜包埋法——是指將酶包埋在由各種高分子聚合物制成的小球內(nèi)，制成固定化酶。

常用半透膜——聚酰胺膜、火棉膠膜等。

3.結(jié)合法——選擇適宜的載體，使之與通過(guò)共價(jià)鍵和離子鍵與酶結(jié)合在一起的固定化方法。分類（結(jié)合鍵不同）：離子鍵結(jié)合法、共價(jià)鍵結(jié)合法1）離子鍵結(jié)合——通過(guò)離子鍵使酶與載體結(jié)合的固定化方法。載體——不溶于水的離子交換劑特點(diǎn)——制備操作簡(jiǎn)單，活力損失較少，但使用時(shí)一定要嚴(yán)格控制好pH值、離子強(qiáng)度和溫度。2）共價(jià)鍵結(jié)合——通過(guò)共價(jià)鍵使酶與載體結(jié)合的固定化方法載體——纖維素、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、甲殼質(zhì)、氨基酸共聚物、甲基丙烯醇共聚物。1）酶活力回收率變化——是指固定化酶所保留下來(lái)的酶的活力與游離酶在固定化之前的酶活力之比。多數(shù)下降2）底物專一性變化——對(duì)分子質(zhì)量大的活性下降3）反應(yīng)的最適pH值變化——不同程度變化4）反應(yīng)的最適溫度變化——高5）米－門常數(shù)變化——多數(shù)偏大6）最大反應(yīng)速度的變化——大多相同（三）固定化法對(duì)酶的影響四、酶的應(yīng)用

1、酶獲得廣泛應(yīng)用的原因1）酶的催化效率高；2）可催化廣泛的化學(xué)反應(yīng)；3）酶源多；4）酶可被修飾改造。2、酶用于污染治理的優(yōu)缺點(diǎn)1)優(yōu)點(diǎn)a.能處理難以生物降解的化合物；b.高、低濃度廢水均適用；c.經(jīng)修飾后其作用范圍相對(duì)較廣；d.過(guò)程控制較簡(jiǎn)便。2）缺點(diǎn)成本較高3、酶工程的發(fā)展展望（1）現(xiàn)狀

生產(chǎn)酶制劑20多種，在食品、輕化工及醫(yī)藥工業(yè)中得到了廣泛的應(yīng)用。與國(guó)外相比不容樂(lè)觀。特別是在以下領(lǐng)域：高產(chǎn)菌株的培育、酶制劑的制備工藝、提高產(chǎn)品質(zhì)量。（2）發(fā)展展望生物傳感器多酶反應(yīng)器的研究酶的改造和新酶的開(kāi)發(fā)酶的分離提純技術(shù)酶的應(yīng)用領(lǐng)域的擴(kuò)展和生產(chǎn)工藝的改進(jìn)第二節(jié)基因工程1.定義：將外源基因體外重組后導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)，使這個(gè)基因能在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯表達(dá)的操作。2.理論和技術(shù)支撐（1）理論：40年代發(fā)現(xiàn)了生物的遺傳物質(zhì)是DNA、50年代弄清了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)、60年代確定了遺傳信息的傳遞方式。（2）技術(shù)：工具酶、DNA序列分析、載體3.基因工程實(shí)施至少四個(gè)必要條件：工具酶、基因、載體、受體細(xì)胞4.基因工程操作的基本技術(shù)5.基因工程在環(huán)境污染治理中的應(yīng)用工具酶限制性核酸內(nèi)切酶——“分子剪刀”一種限制性核酸內(nèi)切酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開(kāi)。大多數(shù)限制酶的識(shí)別序列由6個(gè)核苷酸組成。所識(shí)別序列的中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的。產(chǎn)生的DNA片段末端通常有兩種形式：黏性末端和平末端。DNA連接酶——“分子縫合針”將雙鏈的DNA片段“縫合”起來(lái)，恢復(fù)被限制酶切開(kāi)了的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵。目的基因的提取方法1）DNA序列自動(dòng)測(cè)序儀：對(duì)提取出來(lái)的基因進(jìn)行核苷酸序列分析。2）PCR技術(shù)：使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬(wàn)倍地?cái)U(kuò)增。3）從基因文庫(kù)中獲取目的基因：基因文庫(kù):將含有某種生物不同基因的許多DNA片段,導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存,各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同的基因,稱為基因文庫(kù)?；蚪M文庫(kù):基因文庫(kù)中包含了一種生物所