堿性磷酸酶-基因?qū)嶒?yàn)

編號蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物系

基因工程實(shí)驗(yàn)室本科基因工程實(shí)驗(yàn)論文開題報(bào)告論文題目：堿性磷酸酶基因表達(dá)載體的構(gòu)建及在大腸桿菌中的表達(dá)學(xué)生姓名： 年 級：專 業(yè)：指導(dǎo)教師： 二0一三年八月十二日學(xué)生姓名論文題目開題時(shí)間項(xiàng)目來源 本科生基因工程大實(shí)驗(yàn)課一、立論依據(jù)項(xiàng)目的研究意義，國內(nèi)外研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢分析，主要參考文獻(xiàn)及出處:堿性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP,ALKP)(EC3.1.3.1)屬磷酸單脂酶族，底物專一性較低，廣泛應(yīng)用于表位連鎖圖譜，探針標(biāo)記測序和免疫組織化學(xué)等領(lǐng)域。分子生物學(xué)中，ALP分解寡聚核甘酸的末端單酯化磷酸，是常用的遺傳工程酶。1產(chǎn)堿性磷酸酶的生物有很多，從細(xì)菌到高等哺乳動物均有分布。人血液中的堿性磷酸酶含量是重要的指標(biāo)之一，其檢驗(yàn)結(jié)果及異位表達(dá)對癌癥等許多疾病有著指導(dǎo)意義。2,3目前商業(yè)堿性磷酸酶主要來源于動物(小牛腸堿性磷酸酶)、植物(麥芽)和微生物(細(xì)菌堿性磷酸酶)(Bacterialalkalinephosphatase,BAP)。在革蘭氏陰性細(xì)菌中，BAP表達(dá)于細(xì)胞膜外的周質(zhì)空間。相比表達(dá)于胞內(nèi)使其更機(jī)動和高效。BAP的功能已基本揭示，簡單來說BAP是細(xì)菌產(chǎn)生攝取應(yīng)用的自由磷酸基團(tuán)的一種方式，4被大量的實(shí)驗(yàn)證據(jù)所支持。然而，缺乏BAP的E.coli仍然能夠存活，所以應(yīng)該還存在相關(guān)的替代機(jī)制。5目前，對BAP的研究熱點(diǎn)主要由于其海洋有機(jī)磷利用的酶特性等集中于海洋微生物領(lǐng)域。海洋細(xì)菌堿性磷酸酶的亞細(xì)胞研究揭示了其相關(guān)合成基因及表達(dá)特性對于海洋有機(jī)磷循環(huán)及海洋生物多樣性的貢獻(xiàn)。研究人員證實(shí)了3733種BAP序列(包括PhoA,PhoD,andPhoX)，包含胞質(zhì)分泌及胞外位于不同支載結(jié)構(gòu)。大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持了細(xì)菌于海洋表面部分光耦合的磷攝取機(jī)制。6鑒于磷對于海洋維持初級產(chǎn)能的重要性，并且考慮到其最主要的來源之一一有機(jī)磷分解，海洋生物BAP的分子生物學(xué)研究也是熱點(diǎn)之一。相關(guān)的酶動力學(xué)研究表明，與藻青菌相關(guān)的堿性磷酸酶來說，鈣對于維持其基本活性是必須的。有假說稱其與浮游植物可能是鋅-P共限制的，一些海洋細(xì)菌的BAP可選形式即PhoX是于此相關(guān)的。7此外，分子研究表明，移除BAP的3’磷酸集團(tuán)能夠促進(jìn)碰撞誘導(dǎo)解離時(shí)RNase消化產(chǎn)物分析對的寡核苷酸覆蓋。8另外，ALP于哺乳動物的分子酶動力學(xué)研究與海洋BAP也取得了相應(yīng)的結(jié)果。外生堿性磷酸酶處理補(bǔ)充了結(jié)腸炎的內(nèi)生酶保護(hù)機(jī)制以及抑制了細(xì)菌對大鼠的轉(zhuǎn)座。為AP抵制細(xì)菌轉(zhuǎn)座作用補(bǔ)充了證據(jù)。9本研究對BAP進(jìn)行克隆及表達(dá)研究，能夠?yàn)檫M(jìn)一步的科研研究提供原料，具有一定的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，并無較大科研價(jià)值。參考文獻(xiàn)：l.Tamas,L.,Huttova,J.,Mistrk,I.,Kogan,G.(2002)EectofCarboxymethylChitin-GlucanontheActivityofSomeHydrolyticEnzymesinMaizePlants.Chem.Pap.56(5):326-329.2.Stolbach,L.L.,Krant,M.J.,Fishman,W.H.(1969)EctopicProductionofanAlkalinePhosphataseIsoenzymeinPatientswithCancer.NEnglJMed.281:757-762.Diener,H.C.,Bogousslavsky,J.,Brass,L.M.(2004)Aspirinandclopidogrelcom-paredwithclopidogrelaloneafterrecentischaemicstrokeortransientischaemicattackinhigh-riskpatients(MATCH):ran-domised,double-blind,placebo-controlledtrial.Lancet.364:331-733.Horiuchi,T.,Horiuchi,S.,Mizuno,D.(1959).APossibleNegativeFeedbackPhenomenoncontrollingFormationofAlkalinePhosphomonoesteraseinEscherichiacoli.Nature.183:1529-1530.Wanner,B.L.,PatrickL.(1980).MutantsAffectedinAlkalinePhosphataseExpression:EvidenceforMultiplePositiveRegulatorsofthePhosphateReguloninEscherzchzaColi.Genetics96(2):353-366.Luo,H.W.,Bennera,R.,Long,R.A.,andHu,J.J.(2009)Subcellularlocalizationofmarinebacterialalkalinephosphatases.ProcNatlAcadSci106：21219-21223.Kathuria,S.,Martiny,A.C.(2012)Prevalenceofacalcium-basedalkalinephosphataseassociatedwiththemarinecyanobacteriumProchlorococcusandotheroceanbacteria.EnvMicrobiol.13:4-83.Krivos,K.L.,Addepalli,B.,Limbach,P.A.(2011)RejuhosplhategtoupbybacterialalkalinephosphataseimprovesoligonucleotidesequencecoverageofRNasedigestionproductsanalyzedbycollision-induceddissociationmassspectrometry.RapidCommunMassSpectrom.25:3609-3616.Martinez-Moya,P.,Ortega-Gonzalez,M.,Gonzalez,R.,Anzola,A.,Ocon,B.,Hernandez-Chirlaque,C.,etal.(2012).Exogenousalkalinephosphatasetreatmentcomplementsendogenousenzymeprotectionincolonicinflammationandreducesbacterialtranslocationinrats.PharmacolRes.66:144-153.

實(shí)驗(yàn)進(jìn)度（10天之內(nèi)）：前一夜搖菌。第一天：提取pET-His,pCDNA-BAP；2瓊脂糖凝膠電泳鑒定pET-His,pCDNA-BAP；3以pCDNA-BAP為模版擴(kuò)增目的基因片段。4酶切pET-His。第二天1凝膠回收酶切片段；PCR產(chǎn)物連接；轉(zhuǎn)化E.coli；4搖菌。第三天1IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；2提BAP蛋白；3SDS鑒定。預(yù)期實(shí)驗(yàn)成果：1獲得目的產(chǎn)物BAP；2成功構(gòu)建BAP表達(dá)載體;3撰寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告。曾參