預(yù)防用DNA疫苗臨床前研究技術(shù)指導(dǎo)原則

預(yù)防用DNA疫苗臨床前爭(zhēng)論技術(shù)指導(dǎo)原則一、前言DNA疫苗是將外源目的基因片段構(gòu)建在DNA質(zhì)粒中，重組后的DNA導(dǎo)原適用于以DNA的方案應(yīng)依據(jù)這些原則，確定具體的申報(bào)內(nèi)容。其根本原則是：安全有效，質(zhì)量可控，同DNADNA，務(wù)必制訂標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程及質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，并予嚴(yán)格實(shí)施。二、DNA〔一〕國(guó)內(nèi)外爭(zhēng)論現(xiàn)狀、立題依據(jù)和目的及預(yù)期效果：病的預(yù)防和治療手段。DNA要問題。對(duì)研制該類DNA制品用于預(yù)防疾病的有效性、安全性及必要性進(jìn)展分析。等進(jìn)展分析。凡屬的方案，應(yīng)供給其優(yōu)越性及安全性的依據(jù)。是該方案能否獲得批準(zhǔn)的重要依據(jù)之一。〔二〕DNA測(cè)定DNA對(duì)DNA載體的掌握元件和選擇標(biāo)記的序列與來源，如：真核啟動(dòng)子、增加子、終曇牽好使用無抗性標(biāo)記的DNA性標(biāo)記。對(duì)DNA基因產(chǎn)物表達(dá)的影響以及其利弊權(quán)衡等進(jìn)展分析。試驗(yàn)材料?！踩衬康幕蚧蛐团c其它血清型或基因型穿插反響或穿插保護(hù)性進(jìn)展分析和爭(zhēng)論。對(duì)目的基因的序列、大小、來源以及表達(dá)產(chǎn)物的估量大小進(jìn)展分析；明確目的基因選擇的依據(jù)以及其表達(dá)蛋白在預(yù)防中的作用。基因序列的同源性進(jìn)展分析。假設(shè)在表達(dá)的目的重組蛋白以外有其它氨基酸寡肽同時(shí)表達(dá)時(shí)，應(yīng)對(duì)寡肽的作用和選擇的依據(jù)進(jìn)展分析。并對(duì)基因修飾或重組的利弊權(quán)衡進(jìn)展分析。〔四〕重組質(zhì)粒的構(gòu)建過程1．供給重組體質(zhì)粒構(gòu)建的具體步驟及每一步的鑒定及確證方法。，尤其對(duì)DNA載體的掌握元件和選擇標(biāo)記基因有無變異進(jìn)展分析分析，檢查有無變異。、含量等進(jìn)展分析。對(duì)重組質(zhì)粒的保存條件以及穩(wěn)定性進(jìn)展?fàn)幷??！参濉潮磉_(dá)產(chǎn)物的鑒定將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化適宜的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，對(duì)轉(zhuǎn)化條件進(jìn)展優(yōu)化。建立對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的分析方法，包括表達(dá)產(chǎn)物的大小、特征等。建立對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的免疫學(xué)反響的特征進(jìn)展分析的方法。三、DNA〔一〕建立菌種庫(kù)：對(duì)轉(zhuǎn)化大腸桿菌的條件進(jìn)展優(yōu)化。建立原始種子庫(kù)。對(duì)種子庫(kù)形態(tài)學(xué)，保證細(xì)菌的均一性；應(yīng)檢測(cè)導(dǎo)入基因的存在狀態(tài)。并對(duì)工作細(xì)胞庫(kù)的規(guī)模、保存條〔拷貝數(shù)及表達(dá)量〔二〕對(duì)工作細(xì)胞庫(kù)擴(kuò)增的條件進(jìn)展優(yōu)化，并制定相應(yīng)的質(zhì)控指標(biāo)?！踩硲?yīng)對(duì)DNA制備與純化工藝中各種條件進(jìn)展優(yōu)化，建立穩(wěn)定的純化工藝，并制定相應(yīng)的質(zhì)控指標(biāo)，而且為進(jìn)展臨床試驗(yàn)，應(yīng)建立符合GMP〔四〕對(duì)佐劑或呈遞物質(zhì)的要求假設(shè)在重組DNA終制品中使用佐劑或呈遞物質(zhì)，則對(duì)以下問題進(jìn)展?fàn)幷摶蚬┙o相關(guān)材料:1均未使用過該類佐劑,則必需對(duì)其作用原理、安全性及佐劑效應(yīng)進(jìn)展具體的爭(zhēng)論并建立切實(shí)可行的評(píng)價(jià)方法。不同批號(hào)間保證安全有效的可以到達(dá)的最大均一性的程度進(jìn)展?fàn)幷摌?biāo)準(zhǔn)。DNA結(jié)合均一性的方法，并制定結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)?！参濉臣僭O(shè)與調(diào)整免疫反響的因子等同時(shí)表達(dá)，則應(yīng)對(duì)這類分子進(jìn)展具體的分析，包的藥理和毒理學(xué)爭(zhēng)論。四、藥理、毒理和生物分布DNA是相互關(guān)聯(lián)的，因此，將藥理、毒理和藥代動(dòng)力學(xué)有關(guān)內(nèi)容聯(lián)系在一起進(jìn)展描述?！惨弧趁庖咴曰蛏镄r(jià)的評(píng)價(jià)應(yīng)建立適當(dāng)?shù)脑囼?yàn)及檢測(cè)方法來評(píng)價(jià)該類制品的免疫原性或生物效價(jià)，假設(shè)有動(dòng)物與生物效價(jià)的關(guān)系，通過試驗(yàn)優(yōu)化免疫程序和接種途徑。〔二〕長(zhǎng)久性、耐受性以及生物分布的評(píng)價(jià)由于抗原在機(jī)體內(nèi)長(zhǎng)期表達(dá)可能誘發(fā)機(jī)體的免疫耐受或產(chǎn)生自身免疫反響，應(yīng)對(duì)抗原在機(jī)體中的表達(dá)持續(xù)時(shí)間進(jìn)展動(dòng)力學(xué)分析。由于重組DNA接種到人體以后，機(jī)體可能誘發(fā)產(chǎn)生抗核酸的抗體，應(yīng)建立檢測(cè)抗核酸抗體的檢測(cè)方法，并對(duì)機(jī)體產(chǎn)生該類抗體的狀況進(jìn)展分析。假設(shè)整合到人體基因，可能造成人體基因的斷列或重排而誘發(fā)染色體的不穩(wěn)定性，從而可能產(chǎn)生遺傳毒性或致瘤反響DNA在接種部位組織及其它組織、器官的分布進(jìn)展檢測(cè)分析；對(duì)重組DNA在分布的組織和器官中持續(xù)時(shí)間進(jìn)展追蹤檢測(cè)分析；在分布的組織及器官中是否發(fā)生整合進(jìn)展檢測(cè)DNA制品在生殖腺中是否有分布和整合。假照試驗(yàn)證明重組DNA分布于大局部組織或器官，而且有足夠的證據(jù)證明是否發(fā)生DNA中有與人基因同源性很高的序列或有的潛在的致瘤性基因序列時(shí)，更應(yīng)進(jìn)展致瘤性分析，應(yīng)建立檢測(cè)方法，可以承受細(xì)胞或裸鼠的方法。五、質(zhì)量掌握及檢定的要求〔一〕生產(chǎn)過程中質(zhì)量監(jiān)控標(biāo)準(zhǔn)的建立及要求在生產(chǎn)工藝的各個(gè)環(huán)節(jié)和步驟中對(duì)其產(chǎn)品均應(yīng)建立相應(yīng)的監(jiān)控標(biāo)準(zhǔn)，以便后續(xù)工藝但其原則是保證產(chǎn)品的質(zhì)量、工藝的連續(xù)性和穩(wěn)定性。〔二〕產(chǎn)品的質(zhì)量檢定與要求外觀檢查，依據(jù)樣品的特征建立外觀的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。pH7．2±0．5。DNADNA制品中是否含有宿主RNA、DNA。一般承受瓊脂糖凝膠電泳的方法檢測(cè)制品中有無RNA，要求無明顯的RNA帶型；一般承受Northernblot的方法檢測(cè)制品中殘留的宿主DNA的含量，在該方法的爭(zhēng)論時(shí)應(yīng)建立DNADNADNA0．002ug/ug5mg?！睧LISA〕方法的爭(zhēng)論過程中應(yīng)建立宿主蛋白的定量標(biāo)準(zhǔn)，并對(duì)檢測(cè)方法的敏感性和特異性進(jìn)展驗(yàn)證，其性能能滿足該試驗(yàn)的要求。宿主蛋白的含量應(yīng)不超過0．001ug/ug，每個(gè)人用劑量不超過5ug。260nm280nmA260/A280評(píng)價(jià)制品的總體純度，要求其比值在1．75掃描，分析各帶型所占的比例，一般要求環(huán)狀構(gòu)造的重組質(zhì)粒所占的比例在90%以上。PCR方法對(duì)插入片段進(jìn)展擴(kuò)增或用特征性的酶切方法分析插入的基因片段的大小是否與估量的大小全都。體外效力試驗(yàn)：體外轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，檢測(cè)其表達(dá)量，需建立定量檢測(cè)表達(dá)抗原的方法以及表達(dá)抗原的定量標(biāo)準(zhǔn)，并對(duì)該檢測(cè)方法的敏感性以及定量的準(zhǔn)確性進(jìn)展驗(yàn)證；并進(jìn)展驗(yàn)證。制定各表達(dá)抗原的量和圖譜的質(zhì)量掌握標(biāo)準(zhǔn)。熱原試驗(yàn)：主要檢測(cè)制品中有無熱原物質(zhì)，可用鱟試劑檢測(cè)細(xì)菌的內(nèi)毒素求內(nèi)毒素的含量不高于0．01EU/ug；每個(gè)人用劑量不超過20EU，也可以用其它方法檢測(cè)制品的熱源。抗生素及其它添加物質(zhì)剩余量的檢測(cè)由于DNA載體一般使用抗菌素的選擇性標(biāo)記，重組DNA的研制和制備過程中承受含檢測(cè)抗菌素的檢測(cè)方法并制定抗生素殘留量的要求。在重組DNA的培育和純化工藝中，可能需要一些其它物質(zhì)或基質(zhì)，如純化工藝中可立檢測(cè)方法并制定殘留量的標(biāo)準(zhǔn)。安全性試驗(yàn)：該試驗(yàn)是掌握該類制品質(zhì)量的重要指標(biāo)，由于該制品的與一般生品的特異性安全性。一般性安全試驗(yàn)：主要用小鼠和豚鼠進(jìn)展試驗(yàn)，一般小鼠腹腔接種一個(gè)人用劑量，5穩(wěn)定性試驗(yàn)：由于DNA超螺旋構(gòu)造的不穩(wěn)定性，而且超螺旋構(gòu)造的比例多少可能影響重組DNA性。應(yīng)建立檢測(cè)超螺旋質(zhì)粒穩(wěn)定性的試驗(yàn)方法，并建立相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。生物效價(jià)：由于用于預(yù)防的DNA制劑所發(fā)生作用的原理不同，評(píng)價(jià)其生物效價(jià)的方法也不同。假設(shè)DNA制劑是通過免疫反響發(fā)生作用的，則應(yīng)評(píng)價(jià)其體液免疫和細(xì)胞免疫的生物并對(duì)該類試劑進(jìn)展驗(yàn)證，可以計(jì)算小鼠ED50以及抗體產(chǎn)生的滴度，如有必要和可行，還應(yīng)當(dāng)〔CTL反響的方法或Elispot性強(qiáng)，并制定相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。假設(shè)已有蛋白類疫苗，其評(píng)價(jià)方法應(yīng)參照有關(guān)蛋白類疫苗的評(píng)價(jià)方法。假設(shè)有動(dòng)物模型，可進(jìn)展動(dòng)物保護(hù)性試驗(yàn)。佐劑或呈遞物質(zhì)的質(zhì)量評(píng)價(jià)：如在最終重組DNA制品含有佐劑或呈遞物質(zhì)，則應(yīng)建立檢測(cè)該類