細胞自噬的檢測方法及相關(guān)研究進展

細胞自噬的檢測方法及相關(guān)研究進展

“自我攻擊”的概念由約瑟夫在1973年的《國際碳氫化合體會議》上提出。這意味著特定的分解物質(zhì)、細胞菌和其他顆粒的成分通過轉(zhuǎn)化而分解。顯然，自我攻擊的主要功能之一實際上是在細胞受到刺激和死亡威脅時保持細胞的生存。這是實現(xiàn)真核細胞保持穩(wěn)定、更新和發(fā)展的重要進化機制。廣義上的自我攻擊包括三種類型：巨大的自我攻擊、微的自攻擊和由分子伴侶主導的自我攻擊?，F(xiàn)在的研究結(jié)果表明，這也是一種更廣泛的自我攻擊。時至今日,自噬的研究已經(jīng)成為繼凋亡之后生物醫(yī)學最熱門的領(lǐng)域之一,特別是過去的10年見證了自噬研究的飛速發(fā)展.除維持生理狀態(tài)下機體的穩(wěn)態(tài)功能外,越來越多的研究表明自噬失調(diào)可能與腫瘤、感染、神經(jīng)退行性變等疾病相關(guān).因此,要求研究者在探討自噬的變化及生物學作用時,不僅要觀察自噬現(xiàn)象,尚需監(jiān)測自噬功能的變化并實驗性調(diào)控自噬活性,不僅研究細胞內(nèi)的自噬變化,還需要借助于整體動物模型,并將自噬放到整個機體水平去探討其功能及作用.自噬過程是一系列自噬性結(jié)構(gòu)逐漸演變的過程.自噬被誘導后,細胞內(nèi)形成一種稱為隔離膜(isolationmembrane)或吞噬泡(phagopore)的小囊泡樣結(jié)構(gòu),并與需降解的胞漿成分集結(jié)在一起,然后隔離膜延伸并包裹封閉胞漿成分形成一個雙層膜的結(jié)構(gòu),即自噬體(autophosome),自噬體與溶酶體直接融合形成自噬溶酶體(autopholysome),或先與內(nèi)涵體融合形成自噬內(nèi)涵體(amphisome)后再與溶酶體融合,包裹的胞漿成分最終在溶酶體酶的作用下被降解利用.目前,人們對自噬的檢測主要包括基于檢測自噬體的直接(觀察自噬體的形態(tài))和間接(檢測自噬體表面蛋白標記)的方法以及基于自噬性降解原理設計的一些方法.除此之外,還可通過對自噬通路的調(diào)控來全面評價自噬功能對細胞行為或機體功能的影響,如自噬抑制或激活劑、自噬相關(guān)基因的敲除及沉默等.近年來,一些自噬基因缺陷的動物模型及體內(nèi)自噬活性分析方法的建立使得自噬研究設計更為合理、結(jié)果更具有說服力.需要特別指出的是,在有些文獻上能看到通過一些熒光染料(如lysotracker、monodansylcadaverine、acridineorange)標記的方法檢測溶酶體的數(shù)量和活力來反映自噬,目前認為這種方法缺乏特異性,不能夠代表自噬的出現(xiàn).此外,還有檢測一些自噬相關(guān)蛋白(如Beclin-1、Atg5)的mRNA及蛋白質(zhì)水平表達的方法,實際上,這也不能夠反映自噬的激活,因為在自噬過程中,這些蛋白的激活表現(xiàn)在其翻譯后的修飾以及蛋白間的相互作用,而并不是表達量的增加.在對待以上兩種方法得出的結(jié)論時需理性看待,避免盲從.本文介紹了常用的自噬檢測方法及結(jié)果解釋時的一些問題.1自噬體的識別透射電子顯微鏡是觀察自噬現(xiàn)象的最直接、最經(jīng)典的方法.電鏡檢測自噬主要是基于辨認自噬體結(jié)構(gòu),半個世紀前科學家就借助電鏡最先觀察到了自噬體結(jié)構(gòu).自噬體通常是雙層膜結(jié)構(gòu)包含著未消化的胞漿成分或細胞器(如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)片段),并未與溶酶體融合.電鏡下自噬體內(nèi)容物的形態(tài)和電子密度與胞漿中的一致,因此容易識別.自噬體融合成自噬溶酶體后,則變成單層膜結(jié)構(gòu),其中含有降解不同階段的胞漿成分.一般來說,降解的物質(zhì)電子密度會增加,形成黑色顆粒狀或不定形的聚集,因此也能夠辨認.只是對于晚期自噬溶酶體無法識別內(nèi)容物質(zhì)的來源.在實際操作的時候,如沒有特殊的標記是難以區(qū)分自噬體、自噬內(nèi)涵體和自噬溶酶體等不同成熟階段結(jié)構(gòu)的,因此,只能根據(jù)其內(nèi)容物的結(jié)構(gòu)完整情況大致用初始自噬囊泡(AVi)和降解自噬囊泡(AVd)來表示,其中AVi內(nèi)含的胞漿物質(zhì)結(jié)構(gòu)完整,AVd內(nèi)容物則被不同程度降解.雖然依照上述描述,能夠確認大部分自噬性囊泡,但有以下問題需要注意:a.由于普通透射電鏡切片在制備過程中的處理可影響膜脂質(zhì)成分,因此切片上的自噬體并非都是兩層膜結(jié)構(gòu),有時可能僅有一層膜,有時也可能是多層膜,有時膜結(jié)構(gòu)可能因為脂質(zhì)被提取而無法辨認.因此,是否存在雙層界膜不能作為識別自噬體的依據(jù);b.避免將其他細胞器與自噬體混淆.粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有時會包繞線粒體等細胞器,容易誤認為自噬體.粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)嵴脊有時在電鏡切片上可形成杯狀或環(huán)狀結(jié)構(gòu),酷似自噬體.根據(jù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上有核糖體結(jié)構(gòu)而自噬體膜上無核糖體可鑒別.另外,線粒體也是含雙層界膜的細胞器,腫脹或含有沉淀物的線粒體外觀與自噬體形態(tài)相似,但仔細觀察,線粒體兩層界膜間距一般較小且均一,線粒體內(nèi)膜折疊形成嵴,而自噬體內(nèi)膜不會折疊.c.切片上的電子密度低(electronlucent)或空泡有時也會被誤認為自噬囊泡.電鏡觀察僅能證明自噬性結(jié)構(gòu)的存在,難以反映自噬活性的強弱.Swanlund等介紹了一種免疫金電鏡技術(shù)來對電鏡結(jié)果進行定量分析.通過圖像分析軟件自動測量所有自噬囊泡的面積(μm2),在結(jié)合其他檢測方法的基礎(chǔ)上,如果一個細胞胞漿中被自噬性囊泡所占據(jù)的總面積增加,則可說明自噬機制的上調(diào),同時,這種方法得到的結(jié)論也是對其他方法得出結(jié)果的強有力驗證.2htchia3,lc3-,atg8自噬過程由一系列自噬相關(guān)蛋白(Atg蛋白)介導完成,這些蛋白質(zhì)在自噬體形成的不同階段發(fā)揮作用.微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associatedprotein1lightchain3,LC3/Atg8)是自噬體膜上的標記蛋白.細胞內(nèi)存在兩種形式的LC3蛋白:LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ.LC3蛋白在合成后其C端即被Atg4蛋白酶切割變成LC3-Ⅰ,LC3-Ⅰ散在分布于細胞漿內(nèi).當自噬體形成后,LC3-Ⅰ和磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine,PE)偶聯(lián)形成LC3-Ⅱ并定位于自噬體內(nèi)膜和外膜.與其他一些定位于自噬性結(jié)構(gòu)膜上的Atg蛋白不同(僅在自噬過程的某一階段發(fā)揮作用),LC3-Ⅱ始終穩(wěn)定地保留在自噬體膜上直到與溶酶體融合,因此被用來作為自噬體的標記,且LC3-Ⅱ的水平在某種程度上反映了自噬體的數(shù)量.2.1細胞內(nèi)點聚集數(shù)目和金屬酶檢測LC3-Ⅰ在胞漿內(nèi)彌散分布,LC3-Ⅱ聚集于自噬體膜上,通過免疫熒光的方法檢測內(nèi)源性LC3或轉(zhuǎn)染GFP-LC3融合蛋白的表達,自噬誘導后的細胞表現(xiàn)為點狀聚集增多.理論上,觀察到的點狀聚集的數(shù)目即為自噬體的數(shù)量,根據(jù)點狀聚集的密集程度可以判斷細胞自噬的情況.這種方法僅從總體上大致反映自噬的增加或減少,定量分析則存在局限性.有人通過計數(shù)“含點狀聚集的細胞數(shù)目”試圖對自噬進行定量比較,由于自噬是細胞的生理功能,即便是在正常細胞中也不可避免地會觀察到少量的點狀聚集,因此,這種方法顯然不合適,除非制定一個標準來界定細胞內(nèi)有多少點狀聚集算是該細胞發(fā)生了自噬.另外,如采用計算機軟件來采集點狀聚集信號進行分析,以“細胞群中平均每個細胞所含的點狀聚集數(shù)目或者點狀聚集的總面積”作為細胞免疫熒光的定量比較指標,似乎合乎情理.該方法存在一定的假陽性.因為內(nèi)源性LC3有時會同時表達促聚集蛋白,而當轉(zhuǎn)染(特別是瞬時轉(zhuǎn)染體系)的GFP-LC3基因表達量太高時可能造成非特異性聚集.同時構(gòu)建一個LC3蛋白C端甘氨酸突變的GFP-LC3轉(zhuǎn)染體作為陰性對照,因為該C端突變的LC3蛋白不能夠與PE結(jié)合,因此,可以有效地消除非特異性聚集的影響.2.2自噬體數(shù)量的確定自噬發(fā)生后,通過Western-blot可以檢測到兩個條帶的蛋白質(zhì),盡管LC3-Ⅱ與PE結(jié)合后實際分子質(zhì)量大于LC3-Ⅰ,由于其疏水性較強,在聚丙烯酰胺凝膠中的泳動速度要快于LC3-Ⅰ.由于在自噬時細胞內(nèi)LC3蛋白總的表達水平其實并無上調(diào),僅僅是一部分LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)變成了LC3-Ⅱ,那么理論上自噬時應表現(xiàn)為LC3-Ⅰ的減少和LC3-Ⅱ的增加,通過LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ或者LC3-Ⅱ/(LC3-Ⅰ+LC3-Ⅱ)即可反映自噬水平.但由于二者對抗體結(jié)合能力的差異導致檢測敏感性的不同(LC3-Ⅱ檢測敏感性高于LC3-Ⅰ),實際檢測結(jié)果LC3-Ⅰ的減少并不與LC3-Ⅱ的增加同步,因此上述兩個指標并不能用于比較實際的自噬水平.單純比較LC3-Ⅱ蛋白的水平可能更合適.需要指出的是,即便是比較LC3-Ⅱ的水平,也僅能反映自噬體的數(shù)量,LC3-Ⅱ表達的多少并不意味著自噬活性的強弱.比如說,當細胞自噬活性很強、自噬體降解速度很快時,可能檢測不出LC3-Ⅱ蛋白的表達,或僅有很弱的表達,這種情況下的結(jié)果解釋為自噬活性減弱顯然是不合適的.上述基于LC3的自噬體數(shù)量檢測或LC3表達量的檢測是目前大多數(shù)研究采用的方法,但許多研究錯誤地將觀察到的自噬體的增加減少或LC3表達水平的高低對應于自噬活性的強弱.實際上,自噬活性的增加應該表現(xiàn)為所有自噬性結(jié)構(gòu)(包括隔離膜、自噬體、自噬溶酶體、自噬內(nèi)涵體)均較基礎(chǔ)水平增加.自噬功能障礙可表現(xiàn)在自噬通路的不同階段,自噬體形成的上游通路受阻(如隔離膜的集結(jié)和延伸步驟)時出現(xiàn)自噬體(包括自噬溶酶體和自噬內(nèi)涵體)數(shù)量減少(生成減少),相反,自噬體形成的下游通路受阻時,自噬體數(shù)量可能增加(降解減少).也就是說,自噬體的積聚狀態(tài)反映的可能是自噬的激活,也可能是自噬體形成后的自噬通路受阻.相應地,自噬體數(shù)量的減少可能是由于自噬活性減弱,也可能是自噬性降解增強.例如,在研究神經(jīng)肌肉退行性變時發(fā)現(xiàn)自噬體增加的現(xiàn)象,最初人們認為這類病變是由于或至少部分是由自噬活性增加造成的.后來的實驗證實,這些自噬體的累積實際上是由于自噬活性減弱致自噬體降解減少造成的.因此在任何時間點觀察到的自噬體數(shù)量都是其形成與降解間平衡的結(jié)果,簡單地檢測自噬體的數(shù)量不足以全面評估自噬活性.3自噬活性的模糊分析自噬過程是動態(tài)變化的,而自噬體僅是整個自噬通路過程中的一個中間結(jié)構(gòu).要說明細胞自噬活性的強弱,必須通觀整個自噬的過程是否順利,即通過基于自噬性降解的自噬潮(autophagicflux)分析來進一步說明自噬活性.自噬潮是一個動態(tài)連續(xù)的概念,涵蓋了自噬體的形成、自噬性底物向溶酶體的運送以及在溶酶體內(nèi)降解的整個過程.顯然,對這整個過程進行監(jiān)測較單純自噬體檢測更能反映自噬活性,因此“自噬潮”分析是反映自噬活性的可靠指標.3.1自噬引起的蛋白質(zhì)降解根據(jù)自噬機制主要負責降解長壽命蛋白的特性,先讓細胞在含有同位素標記氨基酸(如14C-或3H-纈氨酸或亮氨酸)的培養(yǎng)基中生長一段時間(數(shù)小時至數(shù)天),細胞在此期間合成的蛋白質(zhì)都將被同位素標記,然后換成不含同位素的培養(yǎng)基,讓一些被標記的短壽命蛋白通過蛋白酶體途徑降解.在自噬誘導后,通過檢測培養(yǎng)上清中釋放的自噬性降解產(chǎn)物的放射性活度即可反映細胞自噬性降解的能力.如同時加入自噬抑制劑作為對比,更能特異性地反映自噬引起的蛋白質(zhì)降解.3.2自噬活性的變化自噬過程中,自噬體內(nèi)膜上的LC3-Ⅱ被溶酶體降解,通過免疫印跡監(jiān)測自噬過程中LC3蛋白量的變化或流式細胞儀監(jiān)測GFP-LC3熒光強度的變化即可反映自噬活性.在自噬誘導一開始,GFP-LC3點狀聚集顯著增多,隨后信號可能會出現(xiàn)下降,代表著自噬性降解的發(fā)生.還有其他一些自噬性降解的底物如p62蛋白,最近已經(jīng)認為可以通過自噬特異性被降解,因此其表達量的變化也可用于監(jiān)測自噬潮.3.3溶酶體抑制劑的影響在LC3蛋白Conversion實驗設計中,同時加入溶酶體抑制劑來抑制自噬體的降解,通過比較溶酶體抑制劑存在與不存在的情況下LC3-Ⅱ蛋白表達的差別來反映自噬性降解.如加入溶酶體抑制劑后,LC3-Ⅱ蛋白表達明顯增強,說明整個自噬和自噬性降解過程的正常,而增強表達的那部分LC3蛋白實際上反映的是被溶酶體降解的自噬體.這種差別在加入處理因素前后的變化即反映自噬活性的大小,如處理因素加入后此差別增加,則代表自噬的增強,反之亦然.常用的溶酶體抑制劑有溶酶體酸化抑制劑氯化銨及氯喹、溶酶體融合抑制劑bafilomycinA1和溶酶體蛋白酶抑制劑E64d、pepstatinA等.3.4將自噬體向溶酶體轉(zhuǎn)化自噬誘導后,融合表達GFP-LC3蛋白錨定于自噬體膜上并與自噬體一起與溶酶體融合,由于GFP不易被溶酶體酶降解,理論上,可以追蹤GFP熒光信號來反映自噬體呈遞至溶酶體的過程來從形態(tài)學上觀察自噬潮.遺憾的是,溶酶體內(nèi)的酸性環(huán)境可以導致GFP熒光信號的猝滅,因此無法實現(xiàn).相反,紅色熒光蛋白RFP對酸性環(huán)境具有很好的耐受性.借助于兩種熒光蛋白的這種差異,通過構(gòu)建RFP-GFP-LC3串聯(lián)體,在自噬誘導后,可以觀察到自噬體和自噬溶酶體分別成黃色和紅色標記,如果自噬潮增加,兩種顏色的點狀聚集均增加.如果自噬體向自噬溶酶體成熟步驟受阻,黃色點狀聚集增加,紅色不增加.這種巧妙的設計實現(xiàn)了自噬體向溶酶體轉(zhuǎn)化步驟的監(jiān)控,不足之處在于不能反映降解過程,溶酶體酶的活力和酸化程度也會影響到熒光信號的檢測.3.5gfp蛋白的降解LC3連同自噬體內(nèi)膜和內(nèi)容物一起被溶酶體降解,但GFP在溶酶體中僅表現(xiàn)熒光信號猝滅,GFP本身并不被降解,在自噬性溶酶體降解后會釋放出游離的GFP.有鑒于此,通過免疫印跡的方法檢測游離GFP蛋白的出現(xiàn)即意味著自噬性降解的發(fā)生.這一方法在酵母中應用較多,在哺乳動物自噬潮的檢測方面還缺乏經(jīng)驗.4抗自噬藥的篩選通過人為的干預來激活或者抑制自噬功能后觀察細胞行為或效應分子的變化能夠使研究結(jié)論更具有說服力.目前,實驗性激活或者抑制自噬的方法有藥物處理、自噬基因敲除、沉默或過表達.常用的抑制自噬及誘導自噬的藥物及機制如表1所示.這些工具藥普遍存在的缺陷就是特異性不強,在抑制自噬的同時對細胞其他代謝過程也可能會有影響.如3-MA抑制ClassⅢPI3K的同時對ClassⅠPI3K同樣也有抑制作用,繼而抑制Akt/mTOR通路,激活自噬.通過RNAi干擾Atg3、Atg5、Atg7及Beclin1等自噬相關(guān)基因的表達后,細胞表現(xiàn)為自噬功能缺失.與工具藥相比,通過基因沉默或敲除技術(shù)來抑制自噬具有相對強的特異性.有時候,一些蛋白質(zhì)在很低的表達量時仍然可以介導自噬發(fā)生,因此,成功基因沉默后的細胞不但不表達被抑制的蛋白質(zhì),而且在自噬誘導劑處理后也不發(fā)生自噬.還有學者通過構(gòu)建顯性負突變體,使一些自噬相關(guān)蛋白失去功能,從而也可抑制自噬的發(fā)生.5gfp熒光檢測體內(nèi)自噬分析的策略有三種:一是傳統(tǒng)的基于對組織切片標本進行電鏡觀察和LC3蛋白的檢測.二是應用GFP-LC3轉(zhuǎn)基因小鼠實現(xiàn)體內(nèi)自噬的實時監(jiān)測,Tian等應用該轉(zhuǎn)基因小鼠,然后借助于體內(nèi)成像技術(shù)經(jīng)顱骨檢測實驗性腦卒中后缺血腦組織區(qū)域GFP熒光強度,實驗結(jié)果與活體外的Westernblot及熒光免疫組化的結(jié)果一致.三是通過構(gòu)建自噬相關(guān)基因缺失的實驗動物,這為研究自噬在機體水平所發(fā)揮的作用并驗證體外試驗的結(jié)果提供了很好的平臺.但是,自噬在體內(nèi)是隨時間不斷變化的,要想準確反映這種變化,必須實現(xiàn)體內(nèi)自噬活性的實時監(jiān)控,而僅憑觀察到的自噬體出現(xiàn)無法說明自噬活