細胞培養(yǎng)基本方法(復蘇、換液、傳代、凍存) - 副本

1細胞培養(yǎng)程璐2目錄

準備及注意事項換液傳代凍存復蘇

MTT3準備事項

紫外燈照射細胞室30分鐘,風機運行10分鐘后方可進入實驗室.穿專用的口罩,帽子,拖鞋,工作衣等.帶手套,并用酒精擦拭之.準備好實驗必需用品.超凈工作臺內操作前用酒精棉球擦拭臺面.超凈工作臺內操作完成后，要用酒精棉球擦拭臺面,除了酒精燈,鑷子,試管架等物品外,其他都要拿出工作臺外.紫外燈照射30分鐘.4換液

把細胞培養(yǎng)瓶從培養(yǎng)箱中拿出,擰緊蓋子;觀察瓶內培養(yǎng)基的顏色,是否渾濁等;放在倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀況。放入超凈工作臺內,點燃酒精燈,拿培養(yǎng)瓶口在酒精燈火焰上轉兩圈以上,至少三秒.取下蓋子,燒瓶口;倒掉培養(yǎng)基,燒瓶口;拿出PBS液瓶子,燒瓶口和鑷子;用鑷子將塞子取出,燒瓶口（至少10圈）。56.用吸管吸取3ml的PBS，打入培養(yǎng)瓶內。燒培養(yǎng)瓶口，來回晃動PBS100次后到掉PBS。重復此操作一次。7.拿出培養(yǎng)基瓶子，燒瓶口和鑷子；用鑷子將塞子取出，燒瓶口（至少10圈）。8.用吸管吸取5ml-8ml的培養(yǎng)基打入培養(yǎng)瓶內，燒瓶口，鑷子和蓋子；9.蓋上蓋子，倒置顯微鏡下觀察，之后標明名稱和日期，酒精棉球擦瓶口和瓶身，放入培養(yǎng)箱內即可。注意：1.打開培養(yǎng)箱時盡量不要說話；2.步驟9中培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱時，應把蓋子擰開少許。6傳代1.把細胞培養(yǎng)瓶從培養(yǎng)箱中拿出，擰緊蓋子；2.觀察瓶內培養(yǎng)基的顏色，是否渾濁等；放在倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀況。3.放入超凈工作臺內，點燃酒精燈，拿培養(yǎng)瓶口在酒精燈火焰上轉兩圈以上，至少三秒。4.取下蓋子，燒瓶口；倒掉培養(yǎng)基，燒瓶口；5.拿出PBS瓶子，燒瓶口和鑷子；用鑷子將塞子取出，燒瓶口（至少10圈）。76.用吸管吸取3ml的PBS，打入培養(yǎng)瓶內。燒培養(yǎng)瓶口，來回晃動PBS100次后到掉PBS。重復此操作一次。7.拿出胰酶瓶子，燒瓶口和鑷子；用鑷子將塞子取出，燒瓶口（至少10圈）。8.用吸管吸取1ml的胰酶，打入培養(yǎng)瓶內，燒培養(yǎng)瓶口和蓋子，蓋上蓋子；9.拿出工作臺外，在倒置顯微鏡下觀察細胞，然后用酒精棉球擦瓶口及瓶身，放入培養(yǎng)箱內；5分鐘后取出；810.在倒置顯微鏡下觀察細胞的消化情況。若細胞變成單個圓形，則可進行傳代。11.拿到工作臺內，燒瓶口，取下蓋子，燒瓶口。用吸管吸出胰酶，燒瓶口。12.拿出培養(yǎng)基瓶子，燒瓶口和鑷子；用鑷子將塞子取出，燒瓶口（至少10圈）。13.用吸管吸取5ml的培養(yǎng)基打入培養(yǎng)瓶內，用吸管吹打成單個細胞懸液。計數(shù)，分裝即可。9凍存1.把細胞培養(yǎng)瓶從培養(yǎng)箱中拿出，擰緊蓋子；2.觀察瓶內培養(yǎng)基的顏色，是否渾濁等；放在倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀況。3.放入超凈工作臺內，點燃酒精燈，拿培養(yǎng)瓶口在酒精燈火焰上轉兩圈以上，至少三秒。4.取下蓋子，燒瓶口；倒掉培養(yǎng)基，燒瓶口；5.拿出PBS瓶子，燒瓶口和鑷子；用鑷子將塞子取出，燒瓶口（至少10圈）。106.用吸管吸取3ml的PBS，打入培養(yǎng)瓶內。燒培養(yǎng)瓶口，來回晃動PBS100次后到掉PBS。重復此操作一次。7.拿出胰酶瓶子，燒瓶口和鑷子；用鑷子將塞子取出，燒瓶口（至少10圈）。8.用吸管吸取1ml的胰酶，打入培養(yǎng)瓶內，燒培養(yǎng)瓶口和蓋子，蓋上蓋子；9.拿出工作臺外，在倒置顯微鏡下觀察細胞，然后用酒精棉球擦瓶口及瓶身，放入培養(yǎng)箱內；5分鐘后取出；10.在倒置顯微鏡下觀察細胞的消化情況。若細胞變成單個圓形，則可進行傳代。1111.拿到工作臺內，燒瓶口，取下蓋子，燒瓶口。用吸管吸出胰酶，燒瓶口。12.拿出培養(yǎng)基瓶子，燒瓶口和鑷子；用鑷子將塞子取出，燒瓶口（至少10圈）。13.用吸管吸取5ml的培養(yǎng)基打入培養(yǎng)瓶內，用吸管吹打成單個細胞懸液。14.用吸管將細胞懸液移至5ml離心管中，蓋上蓋子，在離心機內離心，1500轉/分鐘，時間為15分鐘。15.離心結束后，拿至工作臺內，燒離心管口。去掉塞子，燒管口。1216.棄上清液，加凍存液2ml吹打，使細胞均勻混在凍存液中，再加3ml凍存液，用吸管吸出打入多個凍存管中，每管1.5ml。17.蓋上蓋子，用封口膜封好,標上細胞名稱和日期.18.凍存方式：4℃30分鐘，-20℃15分鐘，-80℃60分鐘，最后轉移到液氮罐內。注意：凍存管移動時要夾在冰塊中間。13復蘇

1.

取一敞口瓶，內裝蒸餾水，放入電熱恒溫水槽中，溫度設置為39.0℃。2.

等達到39.0℃30分鐘后，用鑷子將欲復蘇的細胞從液氮管中取出，快速放入敞口瓶內，晃動，使凍存管內完全液化。3.

用酒精擦拭凍存管，放入工作臺內。4.

用鑷子將封口膜夾掉，輕燒管口；5.

用吸管吸出凍存管內的細胞懸液，打入已裝有5ml新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶內。146.燒瓶口，鑷子和蓋子；蓋上蓋子，在倒置顯微鏡下觀察。7.用酒精棉球擦瓶口及瓶身，放入培養(yǎng)箱內.注意：步驟2中，蒸餾水不要沒過凍存管口所有步驟結束過24小時后一定要換液；15MTT法1.實驗開始前，96孔板應在超凈臺紫外燈下照射2個小時以上。2.從培養(yǎng)箱中拿出培養(yǎng)瓶，觀察，加PBS，加胰酶消化，加培養(yǎng)基，計數(shù)。（方法及步驟同傳代1-13步。）3.加培養(yǎng)基，調整細胞濃度為10000個/200μl.4.加到96孔板內,每板6行8列共48孔,每孔200μl.5.蓋上96孔板的蓋子，拿出工作臺，倒置顯微鏡下觀察，標明名稱，序號和日期。166.用酒精棉球擦板，放入培養(yǎng)箱內，培養(yǎng)24小時。7.從培養(yǎng)箱中取出，鏡下觀察，拿到工作臺內，用200μl的槍將孔內的培養(yǎng)基吸出；8.加入不同濃度的藥物的無血清培養(yǎng)基,每孔200μl。9.蓋上96孔板的蓋子，拿出工作臺，倒置顯微鏡下觀察，用酒精棉球擦板，放入培養(yǎng)箱內，培養(yǎng)24小時。10.從培養(yǎng)箱中取出，鏡下觀察，拿到工作臺內，每孔加MTT液20μl。1711.蓋上96孔板的蓋子，拿出工作臺，倒置顯微鏡下觀察，用酒精棉球擦板，放入培養(yǎng)箱內，培養(yǎng)4小時。12.取出96孔板，倒掉孔內的液體，每孔加

DMSO150μl，放入酶標儀內，振蕩600秒，讀數(shù)即可。注意：

本實驗以CHL細胞為例.加DMSO時，帶口罩和手套。放入酶標儀內時，96孔板勿蓋蓋子。多重復幾次。18溶液的配制PBSRPMI1640培養(yǎng)基消化液凍存液清潔液MTT其它溶液19PBS配制之后，加1000ml三蒸水,調節(jié)PH值在7.2-7.4之間,高壓121℃,30分鐘,4℃?zhèn)溆?。名稱質量(單位:克)NaClKClNa2HPO4.12H2OKH2PO48.000.203.490.2020RPMI1640培養(yǎng)基的配制：取一小袋1640培養(yǎng)粉，加高壓過的三蒸水800ml，在1000ml的燒杯中用玻璃棒攪拌溶解；加碳酸氫鈉2.0g，再加三蒸水定容至1000ml；加青霉素(100U/ml)，鏈霉素（100μg/ml）；在