分子實(shí)驗(yàn)報(bào)告-3

質(zhì)粒DNA和λDNA的酶切、連接、轉(zhuǎn)化及重組子的篩選、鑒定韓陽(yáng)生技一班20071401039實(shí)驗(yàn)原理通過(guò)切割相鄰的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵，導(dǎo)致核酸分子多核苷酸鏈發(fā)生水解斷裂的蛋白酶叫做核酸酶。核酸酶按照水解斷裂核酸分子不同方式分為兩類(lèi)：一類(lèi)是從核酸分子的末端開(kāi)始，一個(gè)一個(gè)核苷酸地消化降解多核苷酸鏈，叫做核酸外切酶；另一類(lèi)是從核酸分子內(nèi)部切割磷酸二酯鍵使之?dāng)嗔殉尚∑危凶龊怂醿?nèi)切酶。限制性核酸內(nèi)切酶：一類(lèi)可以識(shí)別并切割特定DNA序列的核酸內(nèi)切酶。其中以II型內(nèi)切酶最為常用，大多數(shù)II型內(nèi)切酶可以識(shí)別4—8個(gè)核苷酸構(gòu)成的某一核苷酸序列，這一序列通常呈回文結(jié)構(gòu)。一般來(lái)說(shuō)，特異性識(shí)別序列越短，在DNA中出現(xiàn)的頻率越大。限制酶的切割方式有三種，分別產(chǎn)生突出3’的粘性末端、突出5’的粘性末端和平末端，通常粘性末端更容易被DNA連接酶所連接。本實(shí)驗(yàn)使用的HindIII酶特異性識(shí)別DNA序列AAGCTT，并在AA之間處切割產(chǎn)生DNA連接酶：最初是在大腸桿菌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的。它是一種封閉DNA鏈上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA鏈的5'-PO4與另一DNA鏈的3'-OH生成磷酸二酯鍵。但這兩條鏈必須是與同一條互補(bǔ)鏈配對(duì)結(jié)合的(T4DNA連接酶除外)，而且必須是兩條緊鄰DNA鏈才能被DNA連接酶催化成磷酸二酯鍵。常用的DNA連接酶有E.ColiDNA連接酶和T4DNA連接酶，其中前者只能催化雙鏈DNA片段互補(bǔ)粘性末端之間的連接，而后者既可以用于雙鏈DNA片段互補(bǔ)粘性末端之間的連接，還可以催化平末端的連接，但平末端連接效率低。本實(shí)驗(yàn)采用的是T4DNA連接酶。HindiIII：從流感嗜血桿菌d株中發(fā)現(xiàn)并分離的第三種限制酶。酶切方法：1、雙酶切法：如果只在要克隆的目的DNA兩端具有不同的限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)而目的基因內(nèi)部沒(méi)有相應(yīng)的識(shí)別序列，可用兩種限制性內(nèi)切酶切割，則目的DNA可產(chǎn)生兩種不同的黏性末端。選擇同樣具有這兩種限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的合適載體，酶切后，同樣產(chǎn)生兩個(gè)不同的黏性末端，當(dāng)構(gòu)建重組分子時(shí)，目的DNA片段可以一定的方向插入載體中，這樣重組效率高，也有利于重組子的篩選。2、單切酶法：如果目的DNA只能用一種限制性內(nèi)切酶切割，酶切后的片段兩端將產(chǎn)生相同的黏性末端或平末端。選擇具有同樣限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的合適載體在構(gòu)建重組分子時(shí)，除了形成正常的重組子外，還可能出現(xiàn)目的DNA片段以相反方向插入載體分子中，甚至出現(xiàn)載體分子自連，重新環(huán)化的現(xiàn)象，因此重組效率較低。如果沒(méi)有很好的方法區(qū)分轉(zhuǎn)化子中的重組子，篩選重組子的工作量會(huì)很大。pUC19載體在試驗(yàn)中能較簡(jiǎn)單地區(qū)分重組子，因而本實(shí)驗(yàn)采用pUC19+單切酶法的組合。CaCl2制備感受態(tài)細(xì)胞：經(jīng)過(guò)CaCl2處理的細(xì)胞細(xì)胞膜通透性增加，成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞。在低溫下，將攜帶有外源DNA片段的載體與感受態(tài)細(xì)胞混合，經(jīng)過(guò)熱擊或電穿孔技術(shù)，使載體分子進(jìn)入受體細(xì)胞。進(jìn)入受體細(xì)胞的外源DNA分子通過(guò)復(fù)制、表達(dá)，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的性狀。將這些轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)，即可篩選出重組子。本實(shí)驗(yàn)以E.coliDH5菌株為受體細(xì)胞，用CaCl2處理，使其處于感受態(tài)，然后將pUC19質(zhì)粒在42攝氏度下熱擊90s，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。質(zhì)粒pUC19攜帶有氨芐青霉素抗性基因，在含有氨芐青霉素平板上篩選轉(zhuǎn)化子。沒(méi)有導(dǎo)入質(zhì)粒pUC19的受體細(xì)胞，在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)。質(zhì)粒pUC19進(jìn)入E.coliDH5后，通過(guò)-互補(bǔ)作用，形成完整的-半乳糖苷酶。在麥康凱培養(yǎng)基平板上，轉(zhuǎn)化子利用-半乳糖苷酶分解培養(yǎng)基中的乳糖產(chǎn)生有機(jī)酸pH降低，培養(yǎng)基中的指示劑變紅，轉(zhuǎn)化子的菌落變成紅色。不含質(zhì)粒的E.coliDH5，沒(méi)有-半乳糖苷酶活性，不能利用培養(yǎng)基中的乳糖產(chǎn)生有機(jī)酸，而是利用培養(yǎng)基中的有機(jī)碳源，不使培養(yǎng)基中的pH降低，在不含有氨芐青霉素的麥康凱培養(yǎng)基上形成白色菌落。挑取在氨芐青霉素培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的紅色菌落，通過(guò)擴(kuò)增培養(yǎng)，可將轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒提取出來(lái)，然后后續(xù)的酶切，連接等操作?；パa(bǔ)紅白篩選法：pUC19質(zhì)粒含有一個(gè)大腸桿菌DNA的短區(qū)段，其中含有-半乳糖苷酸基因(lacZ)的調(diào)控序列和其N(xiāo)端146個(gè)氨基酸編碼區(qū)。這個(gè)編碼區(qū)中插入一個(gè)多克隆位點(diǎn)。受體菌則含編碼-半乳糖苷酶C端部分序列的編碼信息。二者分別獨(dú)立時(shí)，均沒(méi)有表現(xiàn)出-半乳糖苷酶的活性，當(dāng)外源基因插入后，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入受體菌中，即可有-半乳糖苷酶表達(dá)，這種lacZ基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的-半乳糖苷酶陰性突變體之間實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)的現(xiàn)象叫—互補(bǔ)。在麥康凱培養(yǎng)基上，—互補(bǔ)產(chǎn)生的Lac+細(xì)菌由于含-半乳糖苷酶，能分解麥康凱培養(yǎng)基中的乳糖，產(chǎn)生乳酸，使pH下降，因而產(chǎn)生紅色菌落，而當(dāng)外源片段插入后，失去—互補(bǔ)能力，因而不產(chǎn)生-半乳糖苷酶，無(wú)法分解培養(yǎng)基中的乳糖，菌落呈白色，可將重組質(zhì)粒和自身環(huán)化的載體DNA分開(kāi)，即紅白篩選。酶切鑒定：限制性內(nèi)切酶是一種工具酶，這類(lèi)酶的特點(diǎn)是具有能夠識(shí)別雙鏈DNA分子上的特異核苷酸順序的能力，能在這個(gè)特異性核苷酸序列內(nèi)切斷DNA的雙鏈，形成一定長(zhǎng)度和順序DNA片段。限制性內(nèi)切酶對(duì)環(huán)狀質(zhì)粒DNA有多少切口，就能產(chǎn)生多少酶切片段，因此鑒定酶切后的片段在電泳凝膠的區(qū)帶數(shù)，就可推斷酶切口的數(shù)目，從片段的遷移率可以大致判斷酶切片段大小的差別。用已知相對(duì)分子質(zhì)量的線狀DNA對(duì)照，通過(guò)電泳遷移率的比較，就可以粗略推測(cè)分子形狀相同的未知DNA的相對(duì)分子質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)試劑和器材試劑：去離子水、loadingbuffer、TAE、agarose粉狀、EB溶液、限制性核酸內(nèi)切酶（HindIII）及相應(yīng)緩沖液、T4連接酶及相應(yīng)緩沖液、pUC19商品質(zhì)粒、實(shí)驗(yàn)一提取的pUC19質(zhì)粒、λ噬菌體DNA、100mmol/LCaCl2溶液、LB培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、氨芐青霉素母液、OmegaE.Z.N.A質(zhì)粒提取試劑盒器材：微量移液器、制冰機(jī)、滅菌鍋、恒溫水浴鍋、高速離心機(jī)、電泳儀和電泳槽、凝膠成像儀、Eppendorf管（滅菌）、槍頭及槍頭盒（滅菌）、離心管（滅菌）、恒溫震蕩培養(yǎng)箱、計(jì)時(shí)器、培養(yǎng)皿（滅菌）、500ml錐形瓶及棉塞（滅菌）、大試管及棉塞（滅菌）、試管架、牙簽（滅菌）、實(shí)驗(yàn)步驟（1）感受態(tài)細(xì)胞的制備：1、將E.coliDH5α受體菌接入到LB平板，在37攝氏度的條件下過(guò)夜培養(yǎng)，挑取1%單菌落轉(zhuǎn)接至20mlLB培養(yǎng)基中，在37攝氏度下保溫2.5-3h。2、將處理后的菌液加入到兩只離心管中，每支離心管中為1.5ml。然后將兩只離心管放入離心機(jī)中，在5000rpm轉(zhuǎn)速下10min。3、重復(fù)收集菌體一次，去掉上清液，向管中加入1ml0.1MCaCl2并混勻。然后將兩只管冰浴15min。4、再一次離心，盡可能地棄掉上清液（可以吸干上清液），然后再加入100μl0.1MCaCl2，混勻，然后冰浴4h以上。注意事項(xiàng)：感受態(tài)細(xì)胞必須從純菌種。要從劃線純化的單菌落開(kāi)始，進(jìn)行活化培養(yǎng)，不要使用多次轉(zhuǎn)接或儲(chǔ)存在4攝氏度的培養(yǎng)菌液，其目的是保持菌株的純度和活力。轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，當(dāng)加入外源DNA的量過(guò)多或體積過(guò)大時(shí)，轉(zhuǎn)化效率反而會(huì)降低。一般情況下，DNA溶液的體積不應(yīng)超過(guò)感受態(tài)細(xì)胞體積的5%。轉(zhuǎn)化過(guò)程要防止雜菌和其他DNA的污染，整個(gè)操作過(guò)程均應(yīng)在無(wú)菌條件下進(jìn)行。所用器皿如離心管、吸頭等均為一次性使用的，并經(jīng)過(guò)高溫滅菌處理，所用試劑也需高溫滅菌或過(guò)濾除菌，以防被微生物DNA污染。（2）轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)：1、取三份感受態(tài)細(xì)胞分量分別為50l，50l，100l。第一份50l什么也不加，第二份50l加入22、將三支管都冰浴30min，然后放入到42攝氏度中2min，然后冰浴5min。然后分別加入LB溶液各5003、將培養(yǎng)液分別涂布于含有氨芐青霉素和不含氨芐青霉素的麥康凱培養(yǎng)基平板。4、當(dāng)菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿，于37攝氏度條件下恒溫培養(yǎng)24h。5、根據(jù)生長(zhǎng)狀況挑選重組子。注意事項(xiàng)：轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，當(dāng)加入外源DNA的量過(guò)多或體積過(guò)大時(shí)，轉(zhuǎn)化效率反而會(huì)降低。一般情況下，DNA溶液的體積不應(yīng)超過(guò)感受態(tài)細(xì)胞體積的5%。轉(zhuǎn)化過(guò)程要防止雜菌和其他DNA的污染，整個(gè)操作過(guò)程均應(yīng)在無(wú)菌條件下進(jìn)行。所用器皿如離心管、吸頭等均為一次性使用的，并經(jīng)過(guò)高溫滅菌處理，所用試劑也需高溫滅菌或過(guò)濾除菌，以防被微生物DNA污染。（3）重組子鑒定：將白色的轉(zhuǎn)化子劃線培養(yǎng)到到含氨芐青霉素的麥康凱培養(yǎng)基上，37攝氏度條件下恒溫過(guò)夜。（4）重組質(zhì)粒DNA的提?。?、用接種環(huán)取一環(huán)白色菌落接種到20mlLB溶液中，在37攝氏度條件下過(guò)夜培養(yǎng)，取3ml菌液用試劑盒裝載質(zhì)粒。2、取1.5ml菌液加入到新Eppendorf管，然后在10000rpm條件下離心一分鐘，然后重復(fù)此操作一次，棄掉上清液。3、向棄上清液后的管中加入2504、再向管中加入250l溶液II，5、再加入3506、將離心管放入到離心機(jī)中10000rpm10min。7、小心吸取上清液至柱中（置于收集管中），然后10000rpm離心1min，然后棄掉管中液體。8、加入500lbufferHB于柱中，在離心機(jī)中離心10000rpm1min。棄掉管中液體，加入7009、空柱干燥后放入離心機(jī)中10000rpm2min。10、將空柱置于新管中，加入50（5）重組質(zhì)粒DNA的電泳檢測(cè)四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果及結(jié)果分析1、pUC19質(zhì)粒酶切結(jié)果：123456789101112131415161718現(xiàn)在對(duì)這張電泳圖做一些解釋?zhuān)?：起對(duì)照作用的pUC19和pUC19（HindIII作用）2：起對(duì)照作用的DNAMarker：λ（HindIII作用）3—14組是我們十二個(gè)組的pUC19（HindIII作用）。我們組的是在5號(hào)電泳道上。15-18組是選出的四個(gè)小組多做的4個(gè)λ（HindIII作用）。從圖中可以看出，大多數(shù)組都具有兩條帶，上面的那條為pUC19（HindIII作用），下面那條為pUC19。9號(hào)與13號(hào)電泳圖中只能看出pUC19（HindIII作用）帶，說(shuō)明HindIII對(duì)pUC19切割得較為完整。而除去9號(hào)和13號(hào)的另外10組都或多或少地能看出pUC19來(lái)，說(shuō)明切割沒(méi)有較完整地完成。2、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和紅白篩選：第一組：實(shí)驗(yàn)組：20，50，100，200l此白色菌落為重組質(zhì)粒進(jìn)入受體菌后表達(dá)的結(jié)果，由于重組質(zhì)粒的進(jìn)入，失去—互補(bǔ)能力，因而不產(chǎn)生-半乳糖苷酶，無(wú)法分解培養(yǎng)基中的乳糖，菌落呈白色。而培養(yǎng)液數(shù)量增多，相應(yīng)的等比例得到重組質(zhì)粒的受體菌也就增多，因而菌落數(shù)目增多。第二組：轉(zhuǎn)化對(duì)照組：將50由于轉(zhuǎn)入的是未重組質(zhì)粒，通過(guò)α-互補(bǔ)作用可以優(yōu)先利用培養(yǎng)基中的乳糖作為碳源，乳糖經(jīng)分解生呈酸性物質(zhì)，使中性紅指示劑呈紅色產(chǎn)生紅色菌落。第三組：受體菌對(duì)照組：受體菌在含有氨芐青霉素的麥康凱培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)，而在不含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上長(zhǎng)成白色菌落、由于沒(méi)有轉(zhuǎn)入質(zhì)粒，也就不具有氨芐青霉素抗性基因，也就無(wú)法在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。而在不含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上，不能利用培養(yǎng)基中的乳糖產(chǎn)生有機(jī)酸，而是利用培養(yǎng)基中的有機(jī)碳源，不使培養(yǎng)基pH降低，產(chǎn)生白色菌落。3、酶切驗(yàn)證結(jié)果：1234567891011121314151617181號(hào)為DNAMarker：λ（HindIII作用）2號(hào)為對(duì)照用的pUC193號(hào)到18號(hào)是我們12個(gè)組每個(gè)組做的重組pUC19質(zhì)粒，其中有四個(gè)三人一組的小組多做一